Strategia fosfoproteomica per la profilazione del segnale di stress osmotico in Arabidopsis

Chuan-Chih Hsu; Chia-Feng Tsai; W. Andy Tao; Pengcheng Wang

doi:10.3791/61489

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Articolo metodologico

Strategia fosfoproteomica per la profilazione del segnale di stress osmotico in Arabidopsis

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DOI:

10.3791/61489

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25 giugno 2020

Chuan-Chih Hsu¹^,³ , Chia-Feng Tsai² , W. Andy Tao³^,⁴ , Pengcheng Wang⁵

¹Department of Plant Biology, Carnegie Institute for Science, ²Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University, ³Department of Biochemistry, Purdue University, ⁴Department of Chemistry, Purdue University, ⁵Shanghai Center for Plant Stress Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Chinese Academy of Sciences

In questo articolo

Sommario

Qui è presentato un approccio fosfoproteomico, vale a dire fosfoproteomico a base di punta di estrazione stop and go, che fornisce un'elevata produttività e una copertura profonda del fosfoproteoma arabidopsis. Questo approccio delinea la panoramica della segnalazione dello stress osmotico in Arabidopsis.

Abstract

La fosforilazione proteica è fondamentale per la regolazione dell'attività enzimatica e dell'espressione genica in condizioni osmotiche. La spettrometria di massa (MS) basata sulla fosfoproteomica ha trasformato il modo di studiare la trasduzione del segnale vegetale. Tuttavia, il requisito di molte materie prime e il tempo prolungato di misurazione della SM per raggiungere la profondità di copertura è stato il fattore limitante per lo studio ad alta produttività dei cambiamenti fosfoproteomici globali negli impianti. Per migliorare la sensibilità e la produttività della fosfoproteomica vegetale, abbiamo sviluppato un approccio fosfoproteomica a base di punta stop and go (stage) abbinato all'etichettatura Tandem Mass Tag (TMT) per l'analisi rapida e completa della perturbazione della fosforilazione delle piante in risposta allo stress osmotico. Sfruttando la semplicità e l'elevata produttività della tecnica della punta dello stadio, l'intera procedura richiede circa un'ora utilizzando due punte per completare l'arricchimento del fosfopeptide, il frazionamento e le fasi di pulizia del campione, suggerendo un approccio facile da usare e ad alta efficienza. Questo approccio non solo fornisce un'analisi approfondita della fosfoproteomica vegetale (> 11.000 identificazione del fosfopeptide), ma dimostra anche l'efficienza di separazione superiore (< sovrapposizione del 5%) tra frazioni adiacenti. Inoltre, il multiplexing è stato ottenuto utilizzando l'etichettatura TMT per quantificare i cambiamenti fosfoproteomici delle piante mutanti di decuple di tipo selvaggio e snrk2. Questo approccio è stato utilizzato con successo per rivelare gli eventi di fosforilazione delle chinasi simili alla Raf in risposta allo stress osmotico, che fa luce sulla comprensione della segnalazione osmotica precoce nelle piante terrestri.

Introduzione

L'alta salinità, la bassa temperatura e la siccità causano stress osmotici, che è un importante fattore ambientale che influisce sulla produttività^{delle piante 1,}². La fosforilazione proteica è una delle modifiche post-traslazionali più significative che mediano la percezione del segnale e la trasduzione nella risposta delle piante allo stress^{osmotico 3,}⁴^,⁵. La protein chinasi 2s (SnRK2s) correlata alla SNF1 è coinvolta nella segnalazione dello stress osmotico⁶. Nove dei dieci membri della fami....