シロイヌナズナにおける浸透性ストレスシグナル伝達のプロファイリングのためのホスホプロテオミクス戦略
Summary
ここに提示されるホスホプロテオミクスアプローチ、すなわち、シロイヌモゼスホスファプロテオームのハイスループットと深いカバレッジを提供するリンポプロテオミクスに基づく抽出チップを停止して行く。このアプローチは、シロイヌナズナの浸透性ストレスシグナル伝達の概要を示す。
Abstract
タンパク質リン酸化は、浸透状態下での酵素活性と遺伝子発現の調節に不可欠です。質量分析法(MS)ベースのホスホプロテオミクスは、植物シグナル伝達の研究方法を変えました。しかし、カバレッジの深さを達成するための多くの出発材料と長期のMS測定時間の要件は、植物の世界的なホスホプロテオミクス変化のハイスループット研究の制限要因となっています。植物ホスホプロテオミクスの感度とスループットを向上させるために、浸透応力に応答して植物リン酸化摂動の迅速かつ包括的な分析のためのタンデムマスタグ(TMT)標識と相まって、ストップアンドゴー抽出(ステージ)チップベースのホスホプロテオミクスアプローチを開発しました。ステージチップ技術のシンプルさと高スループットを活用して、全体の手順は、リンペプチド濃縮、分画、およびサンプルクリーニングステップを完了するために2つのヒントを使用して約1時間を要し、アプローチの使いやすく、高い効率を示唆しています。このアプローチは、植物のリンプロテオミクス分析(>11,000リンペプチド同定)を提供するだけでなく、隣接する分画間の優れた分離効率(<5%のオーバーラップ)を示します。また、TMT標識を用いて多重化が行われ、野生型および snrk2 デクプル変異型植物のホスホプロテオミクス変化を定量化した。このアプローチは、陸上植物における初期の浸透シグナル伝達の理解に光を当てる浸透性ストレスに応答して、Raf様キナーゼのリン酸化事象を明らかにするためにうまく使用されている。
Introduction
高いサリン性、低温、干ばつは浸透応力を引き起こし、これは植物の生産性1,2に影響を与える主要な環境要因である。タンパク質リン酸化は、浸透ストレス3、4、5に対する植物応答におけるシグナル知覚および伝達を媒介する最も重要な翻訳後修飾の1つである。SNF1関連プロテインキナーゼ2s(SnRK2s)は、浸透性ストレスシグナル伝達6に関与している。SnRK2ファミリーの10人のメンバーのうち9人は、浸透性ストレス7、8に応答して有意な活性化を示す。snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 10デクサプル(snrk2-dec)全10個のSnRK2に変異を有する変異体は、浸透圧ストレスに対する過敏症を示した。snrk2-dec変異体において、イノシトール1,4,5-トリスリン酸(IP3)の浸透ストレス誘導蓄積、アブシジン酸(ABA)生合成、および遺伝子発現が強く減少し、浸透応力応答におけるSnRK2sの重要な役割を強調する6。しかし、SnRK2sキナーゼがこれらの生物学的プロセスをどのように調節するのかはまだ不明である。浸透性ストレスに応答してホスホプロテオミクスの変化をプロファイリングすることは、このギャップを埋め、植物の浸透性ストレス誘発防御メカニズムを引き出す効率的な方法です。
質量分析法(MS)は植物ホスホプロテオーム9をマッピングするための強力な技術です。しかし、植物ホスホプロテオミクスの特性評価は、植物プロテオームのダイナミックレンジと植物のリセート4の複雑さのために依然として課題である。これらの課題を克服するために、光合成顔料や二次代謝産物などの望ましくない干渉を排除し、植物ホスホプロテオーム10の深い被覆を可能にする普遍的な植物ホスホプロテオミクスワークフローを開発しました。固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)や金属酸化物クロマトグラフィー(MOC)などのいくつかのリンペプチド濃縮方法は、MS分析11、12、13、14、15、16の前にリンペプチドを濃縮するために開発されています。リンペプチドと共に精製する酸性非リンペプチドは、リンペプチド検出のための主要な干渉である。以前は、非リンペプチドの結合を排除するためにIMACローディングバッファーのpH値および有機酸濃度を標準化し、前分画工程11をバイパスして90%以上の濃縮特異性を得た。
リンペプチド濃縮および分画の多段階プロセスにおけるサンプル損失は、リンペプチド同定の感度およびリンタンパク質被覆の深さを妨げる。ストップアンドゴー抽出のヒント(ステージのヒント)は、先端の端部をキャップする小さなディスクを含むピペットチップであり、ペプチド分画および洗浄17のためのクロマトグラフィーと組み込むことができる。段階の先端プロシージャの間のサンプル損失は管間のサンプルの移動を避けることによって最小にすることができる。Ga3+-IMACおよびFe3+-IMACでは、低い多量リン酸化ペプチドを単一リン酸化ペプチドから分離し、ヒトホスホプロテオーム15の深さを改善したステージチップの導入に成功しました。また、高pH逆相(Hp-RP)ステージ先端の使用は、強いカチオン交換(SCX)および強いアニオン交換(SAX)クロマトグラフィー18と比較して、ヒト膜プロテオームの広い範囲を実証している。そのため、IMAC と Hp-RP ステージチップ技術を統合することで、簡単さ、高い特異性、高スループットで植物のホスホプロテオームのカバレッジを向上させることができます。我々は、この戦略が、植物ホスホプロテオーム19の強化された深さを表す、シロイヌナズナの苗から20,000以上のリン酸化部位を同定したことを実証した。
ここでは、 シロイヌナズナ におけるホスホプロテオミクスプロファイリングのためのステージ先端ベースのホスホプロテオミクスプロトコルを報告する。このワークフローは、浸透応力に応答して野生型および snrk2-dec 変異苗のホスホプロテオミクス摂動を研究するために適用された。ホスホプロテオミクス解析では、キナーゼ活性化と初期浸透ストレスシグナル伝達に関与するリン酸化部位が明らかになった。野生型と snrk2-dec 変異型ホスホプロテオームデータの比較分析は、高植物におけるオスモアストレスシグナル伝達において重要な役割を果たすRaf様キナーゼ(RAF)-SnRK2キナーゼカスケードの発見を導いた。
Protocol
Representative Results
Discussion
植物プロテオームとホスホプロテオームのダイナミックレンジと複雑さは、依然としてホスホプロテオミクス分析の深さに対する制限要因です。10,000リン酸化部位21、22を同定するLC-MS/MS分析の単回実行の能力にもかかわらず、植物全体のホスホプロテオームのカバレッジは依然として限られている。そのため、環境ストレスに対応した植物信号ネ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム、グラントXDB27040106によって支えられた。
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
Riferimenti
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