Estratégia fosfoproteômica para traçar sinalização de estresse osmótico em Arabidopsis
Summary
Apresentada aqui é uma abordagem fosfoproteômica, ou seja, parar e ir extração baseada em fosfoproteômica, que fornece alta produtividade e cobertura profunda de fosfoproteome arabidopsis. Esta abordagem delineia a visão geral da sinalização de estresse osmótico em Arabidopsis.
Abstract
A fosforilação proteica é crucial para a regulação da atividade enzimática e expressão genética sob condição osmótica. A espectrometria de massa (masfoproteômica baseada em MS) transformou a maneira de estudar a transdução de sinal vegetal. No entanto, a exigência de muitos materiais iniciais e tempo de medição prolongado de MS para alcançar a profundidade da cobertura tem sido o fator limitante para o estudo de alto rendimento das mudanças fosfoproteômicas globais nas plantas. Para melhorar a sensibilidade e o throughput da fosfoproteômica vegetal, desenvolvemos uma abordagem de fosfoproteômica baseada em ponta (estágio) em conjunto com a rotulagem tandem mass tag (TMT) para a análise rápida e abrangente da perturbação da fosforilação vegetal em resposta ao estresse osmótico. Aproveitando a simplicidade e o alto rendimento da técnica de ponta de palco, todo o procedimento leva aproximadamente uma hora usando duas dicas para finalizar o enriquecimento de fosforpecida, fracionamento e etapas de limpeza de amostras, sugerindo uma facilidade de uso e alta eficiência da abordagem. Essa abordagem não só fornece uma análise de fosfoproteômica vegetal aprofundada (> 11.000 identificação de fosfopeptídeo), mas também demonstra a eficiência de separação superior (< 5% sobreposição) entre frações adjacentes. Além disso, o multiplexing foi alcançado usando rotulagem TMT para quantificar as alterações fosfoproteômicas de plantas mutantes desocuple tipo selvagem e snrk2. Esta abordagem tem sido usada com sucesso para revelar os eventos de fosforilação de cinesases semelhantes a Raf em resposta ao estresse osmótico, que lança luz sobre a compreensão da sinalização osmótica precoce em plantas terrestres.
Introduction
Alta salinidade, baixa temperatura e seca causam estresses osmóticos, que é um dos principais fatores ambientais que afetam a produtividade das plantas1,2. A fosforilação proteica é uma das modificações pós-translacionais mais significativas que mediam a percepção e transdução do sinal na resposta vegetal ao estresse osmótico3,4,5. A proteína quinase 2s (SnRK2s) relacionada ao SNF1 está envolvida na sinalização de estresse osmótico6. Nove dos dez membros da família SnRK2 mostram ativação significativa em resposta ao estresse osmótico7,8. O mutante snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dez) mutante com mutações em todos os dez SnRK2 exibiu hipersensibilidade ao estresse osmótico. No mutante snrk2-dec, o acúmulo induzido pelo estresse osmótico de inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3),biossíntese de ácido abscisico (ABA) e expressões genéticas são fortemente reduzidas, destacando o papel vital do SnRK2s nas respostas ao estresse osmótico6. No entanto, ainda não está claro como os kinases SnRK2s regulam esses processos biológicos. Traçar o perfil das mudanças fosfoproteômicas em resposta ao estresse osmótico é uma maneira eficiente de preencher essa lacuna e delinear os mecanismos de defesa desencadeados pelo estresse osmótico nas plantas.
Espectrometria de massa (MS) é uma técnica poderosa para mapear o fosfoproteome vegetal9. A caracterização da fosfoproteômica vegetal, no entanto, continua sendo um desafio devido ao alcance dinâmico do proteome vegetal e à complexidade do lysatevegetal 4. Para superar esses desafios, desenvolvemos um fluxo de trabalho fosfoproteômico universal de plantas, que elimina interferências indesejadas, como pigmentos fotossintéticos e metabólitos secundários, e permite a cobertura profunda do fosfoproteomevegetal 10. Vários métodos de enriquecimento de fosfopeptídeos, como cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados (IMAC) e cromatografia de óxido de metal (MOC) foram desenvolvidos para enriquecer fosfopeptídeos antes da análise de MS11,12,13,14,15,16. Os não fosfopeptídeos ácidos co-purificadores com fosfopeptídeos são as principais interferências para a detecção de fosfopeptídeos. Anteriormente, padronizamos o valor do pH e a concentração de ácido orgânico do tampão de carga IMAC para eliminar a vinculação de não fosfopeptídeos, para obter mais de 90% de especificidade de enriquecimento contornando a etapa de pré-fracionamento11.
A perda de amostras no processo de várias etapas de enriquecimento e fracionamento de fosfopeptídeo dificulta a sensibilidade da identificação de fosfopeptídeo e a profundidade da cobertura fosfoproteômica. As dicas de parassar e fazer extração (pontas de palco) são pontas de pipeta que contêm pequenos discos para tampar a ponta, que podem ser incorporadas com cromatografia para fracionamento de peptídeos e limpeza17. A perda amostral durante o procedimento da ponta de estágio pode ser minimizada evitando a transferência de amostras entre os tubos. Implementamos com sucesso a ponta de estágio em Ga3+-IMAC e Fe3+-IMAC para separar peptídeos múltiplos de fosfoiltos de fosforilados baixos de peptídeos fosfoilados, que melhoraram a profundidade do fosfoproteome humano15. Além disso, o uso de ponta de estágio de fase de fase de alta fase reversa de pH (Hp-RP) demonstrou a maior cobertura do proteome da membrana humana em comparação com a da forte troca de cation (SCX) e da forte cromatografia de troca de ânion (SAX)18. Portanto, integrar técnicas de ponta de estágio IMAC e Hp-RP pode aumentar a cobertura de fosfoprotetor de plantas com simplicidade, alta especificidade e alto rendimento. Demonstramos que essa estratégia identificou mais de 20.000 sítios de fosforilação de mudas arabidopsis, representando uma profundidade aprimorada de fosfoproteome vegetal19.
Aqui, relatamos um protocolo fosfoproteômico baseado em pontas de palco para perfil fosfoproteômico em Arabidopsis. Este fluxo de trabalho foi aplicado para estudar a perturbação fosfoproteômica de mudas mutantes do tipo selvagem e snrk2-dec em resposta ao estresse osmótico. A análise fosfoproteômica revelou os locais de fosforilação implicados na ativação da quinase e na sinalização de estresse osmótico precoce. A análise comparativa dos dados de fosfoproteome mutante do tipo selvagem e snrk2-dec levou à descoberta de uma cascata de quinase semelhante a Raf (RAF)-SnRK2, que desempenha um papel fundamental na sinalização de tensão dos osmore em plantas altas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O alcance dinâmico e a complexidade do proteome vegetal e do fosfoproteome ainda são um fator limitante à profundidade das análises fosfoproteômicas. Apesar da capacidade de análise lc-MS/MS de execução única para identificar 10.000 locais de fosforilação21,22, a cobertura de todo o fosfoproteome vegetal ainda é limitada. Portanto, é necessário um fluxo de trabalho fosfoproteômico que ofereça alta sensibilidade e eficiência de separação superio…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Estratégica Prioritária da Academia Chinesa de Ciências, Grant XDB27040106.
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
Riferimenti
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
