חיזוי קטיעה באמצעות תאי אב מונונוקלאואריים במחזור מקומי בחולים שטופלו באנגיופלסטיקה עם איסכמיה קריטית של הגפיים
Summary
קטיעה בגפיים התחתונות עלולה להתרחש גם לאחר אנגיופלסטיקה של כלי דם חסומים באיסכמיה של גפיים קריטיות (CLI). תאי אב מונונוקולריים (MPCs) משקפים תיקון כלי דם. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכימות של MPCs מהמחזור קרוב אנגיופלסטיקה, ואת הקשר שלה עם תפקוד אנדותל וחיזוי של קטיעה בגפיים התחתונות.
Abstract
איסכמיה קריטית של הגפיים (CLI) מייצגת שלב מתקדם של מחלת העורקים ההיקפית. אנגיופלסטיקה משפרת את זרימת הדם לגפה התחתונה; עם זאת, חלק מהחולים להתקדם באופן בלתי הפיך לקטיעה בגפיים. היקף הנזק לכלי הדם ואת המנגנונים של תיקון כלי הדם הם גורמים המשפיעים על התוצאה שלאחר אנגיופלסטיקה. תאי אב מונונוקולריים (MPCs) מגיבים לנזק כלי דם ותיקון, עם היכולת לשקף מחלות כלי דם. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כימות של MPCs המתקבלים ממחזור הדם מכלי קרוב לאתר אנגיופלסטיקה, כמו גם את הקשר שלה עם תפקוד אנדותל ואת יכולת החיזוי שלה לקטיעה גפיים ב -30 הימים הבאים לאחר אנגיופלסטיקה בחולים עם CLI.
Introduction
מחלת עורקים היקפית (PAD) מאופיינת בחסימה כלי דם כרונית ומתקדמת עם הגבלת אספקת הדם1. בקנה מידה עולמי, PAD של הגפיים התחתונות משפיע על כ -10% מהאוכלוסייה המבוגרת, בעוד עד 7% מהמקרים האלה מוגשים לקטיעה גפיים2,3.
איסכמיה גפיים קריטיות (CLI) מייצגת את המצגת החמורה ביותר של PAD1. חולים בדרך כלל חווים כאב במנוחה, כיבים, או נמק המיוחס לעורקים occluded; בעוד פרוגנוזה קלינית היא שלילית מסומן על ידי סיכון של 30% של קטיעה ותמותה במהלך 1 שנה3,4,5.
אנגיופלסטיקה היא הליך אנדווסקולרי זעיר פולשני שיכול להחזיר את זרימת הדם לגפה התחתונה בחולים עם CLI; עם זאת, חלק מהחולים בהכרח דורשים קטיעה גדולה של הגפיים, גם לאחר טיפול אנגיופלסטיקה1,5. זיהוי מוקדם של תוצאות שליליות לאחר אנגיופלסטיקה הוא בעל ערך רב למדי, בשל האפשרות של אכיפה טיפולית.
גורמי סיכון מסורתיים עשויים לספק יכולת חיזוי מוגבלת לקטיעה משמעותית של הגפיים בחולים עם CLI העוברים אנגיופלסטיקה6. סמנים ביולוגיים מונחי פתופיזיולוגיה מייצגים שיטות חדשניות עם יישומים קליניים פוטנציאליים, אשר עשוי לגרום שימושי במיוחד במחלות הקשורות לפציעה בכלי הדם7. כיום, ההשתתפות של אוכלוסיות הסלולר בעלות תכונות תיקון אנדותל, באתר של לוח טרשת עורקים, הוכרה יותרויותר 8,9.
תאי אב מונונוקולריים (MPCs) נגזרים ממח העצם ומאפיינים מבניים ותפקודיים משלו של תאי גזע עם יכולות רגנרטיביות של כלי הדם. בשל היכולת של MPC להתרבות, לנדוד ולהראות דבקות בכלי הדם; תאים אלה הפכו מועמדים טובים כדי לשקף תיקון אנדותל בתגובה איסכמיה10,11,12. בנוסף, עניין מתמשך במנגנונים שבבסיס פגיעה בכלי הדם הניע לחקור את התפקיד הפרוגנוסטי של סמנים ביולוגיים מקומיים המתרחשים, שכן הם נחשבים לשקף נזק לכלי הדם ולתקן7,13,14.
מטרת המחקר הנוכחי היא לתאר כיצד לקבוע את כמות חברי הפרלמנט המסתובבים קרוב לחסימת כלי הדם בחולים עם CLI שעברו אנגיופלסטיקה; וכיצד להעריך את הקשר בין חברי פרלמנט עם אינדיקטורים של תפקוד לקוי של אנדותל וכריתת איברים.
בהשוואה לפרוגנוזה המבוססת על מחלות רקע ותכונות כלי דם מהותיות, כמות חברי הפרלמנט המקומיים מראה יכולת ספציפית לחזות תוצאה קלינית לגבי תפקוד לקוי של אנדותל וכריתת גפיים. באופן עקבי, מספר מחקרים תיארו את התפקיד הפרוגנוסטי של סמנים ביולוגיים דומים במהלך הערכת חולים עם PAD15,16.
בהתבסס על תוצאותקודמות 7, השיטה המתוארת כאן עשויה להיות שימושית לזיהוי מוקדם של האוכלוסייה בסיכון לתוצאות כלי דם שליליות במספר הגדרות קליניות, כגון גפיים תחתונות ואיסכמיה כלילית, שבץ מוחי, דלקת כלי דם, פקקת ורידית ואחרים הכרוכים בפגיעה בכלי הדם ותיקון.
Protocol
Representative Results
Discussion
איסוף דם באתר המדויק של בלוק כלי הדם עשוי להראות קשיים טכניים; לכן, ביצענו איסוף דם בסמיכות לבלוק כלי הדם. כמו כן, כמות MPCs קרוב ללוח כלי הדם נראה דינמי מאוד ועשויים מקורם וריאציות לפני ואחרי אנגיופלסטיקה. על פי התצפיות שלנו, מומלץ להעריך שינויים בסיסיים- ו -30 דקות לאחר אנגיופלסטיקה במספר MPCs, ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לתמיכת התוכנית המוסדית E015 על מזהה הפרויקט 356.2015.
Materials
| BSA | Roche | 10735086001 | Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending. |
| Calibration Beads | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-607 | MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests |
| CD133/1 (AC133)-PE | Milteny Biotec / MACS | #130-080-801 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 | Miltenyi Biotec / MACS | #130-103-798 | Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated |
| CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-093-601 | Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer |
| CD34-FITC | Miltenyi Biotec / MACS | #130-081-001 | The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34 |
| CD45- VioBlue | Miltenyi Biotec / MACS | #130-092-880 | Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated |
| Conical Tubes | Thermo SCIENTIFIC | #339651 | 15ml conical centrifuge tubes |
| Cytometry Tubes | FALCON Corning Brand | #352052 | 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12×75 style. Sterile. |
| EDTA | BIO-RAD | #161-0729 | Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe<0.01%, As<1ppm, Insolubles<0.005% |
| Improved Neubauer | Without brand | Without catalog number | Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2) |
| K2 EDTA Blood Collection Tubes | BD Vacutainer | #367863 | Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL. |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 01-63-12-002-A | Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | #SZBF0920V | Fixation of biological samples, (powder, 95%) |
| Pipette Transfer 1,3mL | CRM Globe | PF1016, PF1015 | The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy. |
| Test Tubes | KIMBLE CHASE | 45060 13100 | Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm |
Riferimenti
- Serrano-Hernando, F. J., Martín-Conejero, A. Peripheral artery disease: Pathophysiology, diagnosis and treatment. Revista Española de Cardiología. 60 (9), 969-982 (2007).
- Agarwal, S., et al. Burden of re-admissions among patients with critical limb ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 69 (15), 1897-1908 (2017).
- Kolte, D., et al. Thirty-day re-admissions after endovascular or surgical therapy for critical limb ischemia: Analysis of the 2013 to 2014 nationwide re-admissions databases. Circulation. 136 (2), 167-176 (2017).
- Rowlands, T. E., Donnelly, R. Medical therapy for intermittent claudication. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 34, 314-321 (2007).
- Cronewett, J. L. . Acute limb ischemia and lower extremity chronic arterial disease: Rutherford’s vascular surgery (8th ed.). , (2014).
- Dick, F., et al. Surgical or endovascular revascularization in patients with critical limb ischemia: influence of diabetes mellitus on clinical outcome. Journal of Vascular Surgery. 45 (4), 751-761 (2007).
- Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
- Franz, R., et al. Use of autologous bone marrow mononuclear cell implantation therapy as a limb salvage procedure in patients with severe peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. 50 (6), 1378-1390 (2009).
- Benoit, E., O’Donnell, T. F., Patel, A. N. Safety and efficacy of autologous cell therapy in critical limb ischemia: A systematic review. Cellular Transplantation. 22 (3), 545-562 (2013).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. New England Journal of Medicine. 348 (7), 593-600 (2003).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Smadja, D. M. Early endothelial progenitor cells in bone marrow are a biomarker of cell therapy success in patients with critical limb ischemia. Cytotherapy. 14 (2), 232-239 (2012).
- Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
- Truong, Q. A., Januzzi, J. L., Szymonifka, J., Thai, W. E., Wai, B., Lavender, Z. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
- Ding, N., et al. Fibrosis and inflammatory markers and long-term risk of peripheral artery disease: The ARIC study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40 (9), 2322-2331 (2020).
- Potier, L., et al. Plasma copeptin and risk of lower-extremity amputation in Type 1 and Type 2 diabetes. Diabetes Care. 40 (12), 2290-2297 (2019).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), 13790 (2010).
- Marboeuf, P., et al. Inflammation triggers colony forming endothelial cell mobilization after angioplasty in chronic lower limb ischemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (1), 195-197 (2008).
- Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: Time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
