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Medicina

Accès à la cytotoxicité et à la réponse cellulaire aux biomatériaux

Published: July 08, 2021
doi:
10.3791/61512
, , , , , , , , ,
1Institute of Integrated Clinical Practice, Faculty of Medicine,University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO),University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 3Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB),University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 4Clinical Academic Center of Coimbra, CACC, Portugal, 5Institute of Biophysics, Faculty of Medicine,University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 6Laboratory of Oncobiology and Hematology, Faculty of Medicine,University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 7Institute of Endodontics, Faculty of Medicine,University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine,University of Coimbra, Coimbra, Portugal

Summary

Cette méthodologie vise à évaluer la cytotoxicité des biomatériaux par la préparation d’extraits solubles, en utilisant des essais de viabilité et des analyses phénotypiques, y compris la cytométrie en flux, la RT-PCR, l’immunocytochimie et d’autres techniques de biologie cellulaire et moléculaire.

Abstract

Les biomatériaux entrent en contact direct ou indirect avec les tissus humains, d’où l’importance d’évaluer leur cytotoxicité. Cette évaluation peut être réalisée par plusieurs méthodes, mais il existe un écart important entre les approches utilisées, ce qui compromet la reproductibilité et la comparaison entre les résultats obtenus. Dans cet article, nous proposons un protocole pour évaluer la cytotoxicité des biomatériaux à l’aide d’extraits solubles, que nous utilisons pour les biomatériaux dentaires. La préparation des extraits est détaillée, de la production des granulés à leur extraction dans un milieu de culture. L’évaluation de la cytotoxicité des biomatériaux est basée sur l’activité métabolique à l’aide du test MTT, la viabilité cellulaire à l’aide du test de sulforhodamine B (SBR), le profil de mort cellulaire par cytométrie en flux et la morphologie cellulaire à l’aide de May-Grünwald Giemsa. En plus de l’évaluation de la cytotoxicité, un protocole d’évaluation de la fonction cellulaire est décrit en fonction de l’expression de marqueurs spécifiques évalués par immunocytochimie et PCR. Ce protocole fournit un guide complet pour l’évaluation de la cytotoxicité des biomatériaux et des effets cellulaires, en utilisant la méthodologie des extraits, de manière reproductible et robuste.

Introduction

La biocompatibilité peut être définie comme la capacité d’un matériau à intégrer les tissus et à induire une réponse thérapeutique favorable, exempte de dommages locaux et systémiques 1,2,3. L’évaluation de la biocompatibilité est cruciale pour le développement de tout matériau destiné à un usage médical. Par conséquent, ce protocole fournit une approche systématique et complète pour chaque chercheur visant à développer de nouveaux biomatériaux ou à étudier de nouvelles applications pour les biomatériaux existants.

Les tests de cytotoxicité in vitro sont largement utilisés comme première phase pour l’évaluation de la biocompatibilité, en utilisant des cultures cellulaires primaires ou des lignées cellulaires. Les résultats constituent un premier indicateur d’application clinique potentielle. En plus d’être essentiels pour le développement de biomatériaux, ces tests sont obligatoires pour se conformer aux réglementations en vigueur pour l’introduction sur le marché, des régulateurs de l’UE et de l’UE (certification FDA et CE)4,5,6,7,8. En outre, les tests standardisés dans la recherche biomédicale offrent un avantage significatif en termes de reproductibilité et de comparaison des résultats de différentes études sur des biomatériaux ou des dispositifs similaires9.

Les lignes directrices de l’Organisation internationale de normalisation (ISO) sont largement utilisées par de nombreux laboratoires commerciaux, réglementaires et universitaires indépendants pour tester les matériaux de manière précise et reproductible. L’ISO 10993-5 fait référence à l’évaluation de la cytotoxicité in vitro et l’ISO 10993-12 rend compte de la préparation de l’échantillonnage10,11. Pour les essais de biomatériaux, trois catégories sont fournies, à sélectionner en fonction du type de matériau, des tissus en contact et de l’objectif du traitement : extraits, contact direct et contact indirect 8,11,12,13. Les extraits sont obtenus en enrichissant un milieu de culture cellulaire avec le biomatériau. Pour les tests par contact direct, le biomatériau est placé directement sur les cultures cellulaires et, en contact indirect, l’incubation avec les cellules est réalisée séparées par une barrière, telle qu’un gel d’agarose11. Des contrôles appropriés sont obligatoires et au moins trois expériences indépendantes doivent être effectuées 5,8,10,11,14.

Il est essentiel de simuler ou d’exagérer les conditions cliniques pour déterminer le potentiel cytotoxique. Dans le cas de l’essai d’extraits, la surface du matériau;  le volume moyen; le milieu et le pH du matériau; la solubilité, l’osmolarité et le rapport de diffusion des matériaux; et les conditions d’extraction telles que l’agitation, la température et le temps influencent les milieuxenrichisseurs 5.

La méthodologie permet l’évaluation quantitative et qualitative de la cytotoxicité de plusieurs formulations pharmaceutiques, solides et liquides. Plusieurs tests peuvent être effectués, tels que le test d’absorption du rouge neutre, le test de formation de colonies, le test MTT et le test XTT 5,10,14.

La plupart des études d’évaluation de la cytotoxicité publiées utilisent des tests plus simples, à savoir MTT et XTT, qui fournissent des informations limitées. L’évaluation de la biocompatibilité ne devrait pas seulement impliquer l’évaluation de la cytotoxicité, mais aussi la bioactivité d’une substance d’essai donnée2, comme le confirme ce protocole. Des critères d’évaluation supplémentaires devraient être utilisés lorsque cela est justifié et documenté. Ainsi, ce protocole vise à fournir un guide complet, détaillant un ensemble de méthodes pour l’évaluation de la cytotoxicité des biomatériaux. En outre, l’évaluation de différents processus cellulaires, à savoir le type de mort cellulaire, la morphologie cellulaire, la fonction cellulaire dans la synthèse de protéines spécifiques et la production tissulaire spécifique, sont décrites.

Protocol

1. Préparation des granulés Préparer les moules en polychlorure de vinyle (PVC) en effectuant des trous de forme circulaire de dimensions connues dans des plaques de PVC.REMARQUE: Les moulures en PVC peuvent être faites de différentes tailles. Calculez la surface de contact des moules en PVC, en utilisant la formule A = h(2πr) + 2πr2 (r: rayon du cylindre; h: hauteur du cylindre). Préparer le biomatériau à tester selon les instructions du fabricant et le plus près possible du…

Representative Results

Les résultats représentatifs se réfèrent ici à l’étude des biomatériaux dentaires. La méthodologie de l’extrait permet d’obtenir un profil de cytotoxicité et de fonction cellulaire après exposition au matériel dentaire, en ce qui concerne les effets sur l’activité métabolique (Figure 2), la viabilité cellulaire, le profil de mort cellulaire et la morphologie cellulaire (Figure 3), et l’expression de protéines spécifiques (Figure 4).<str…

Discussion

Ce protocole a été conçu en tenant compte de la norme ISO 10993-5, qui fait référence à l’évaluation de la cytotoxicité in vitro des biomatériaux en contact avec les tissus, afin d’évaluer la biocompatibilité et de contribuer aux études de reproductibilité21. C’est une préoccupation croissante en science, et de nombreux auteurs suivent déjà ces recommandations dans la conception expérimentale de leurs études in vitro 15,22,23,24,25,26,27,28.…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les personnes suivantes pour leur soutien: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); Le CIBB est financé par des fonds nationaux via FCT (Foundation for Science and Technology) à travers les projets stratégiques UIDB/04539/2020 et UIDP/04539/2020 (CIBB). Nous remercions Jacques Nör, de la faculté dentaire de l’Université du Michigan, d’avoir fourni la lignée cellulaire MDPC-23.

Materials

Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CaCl2 Sigma 10035-04-8
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
DAB + Chromogen Dako K3468
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 Santa Cruz Biotechnology LS-C20939
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Hepes 0.01 M Sigma MFCD00006158
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Giemsa Stain, modified GS-500 Sigma MFCD00081642
Glycerol Dako C0563
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
May-Grünwald Stain MG500 Sigma MFCD00131580
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 Dako G-21234
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Substrate Buffer Dako 926605
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
β-actin antibody Sigma A5316
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Riferimenti

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Paula, A. B., Laranjo, M., Coelho, A. S., Abrantes, A. M., Gonçalves, A. C., Sarmento-Ribeiro, A. B., Ferreira, M. M., Botelho, M. F., Marto, C. M., Carrilho, E. Accessing the Cytotoxicity and Cell Response to Biomaterials. J. Vis. Exp. (173), e61512, doi:10.3791/61512 (2021).
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