हम स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण के साथ संगत मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) संस्कृतियों और न्यूरोनल अंतर के स्वचालन दिखाते हैं।
मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) के लिए मैनुअल संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल को मानकीकृत करना मुश्किल है, उच्च परिवर्तनशीलता दिखाना और अवांछित कोशिका प्रकारों में सहज भेदभाव का खतरा है। तरीके श्रम-प्रधान हैं और बड़े पैमाने पर प्रयोगों के लिए आसानी से उत्तरदायी नहीं हैं। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने एक स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली विकसित की है जो एक उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग सिस्टम के साथ मिलकर और समानांतर और न्यूरोनल भेदभाव में कई हिप्ससी लाइनों को बनाए रखने के लिए प्रोटोकॉल लागू की गई है। हम 6 \u20128 दिनों के भीतर हिप्ससी-व्युत्पन्न कॉर्टिकल न्यूरॉन्स का उत्पादन करने के लिए न्यूरोजेनिन-2 (एनजीएन 2) ओवर-एक्सप्रेशन का उपयोग करके एक अल्पकालिक भेदभाव प्रोटोकॉल के स्वचालन का वर्णन करते हैं, और 65 दिनों के भीतर हिप्ससी-व्युत्पन्न मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए दीर्घकालिक भेदभाव प्रोटोकॉल का कार्यान्वयन। इसके अलावा, हमने जीएफपी लेंटीवायरस के साथ स्थानांतरित एक छोटे अणु-व्युत्पन्न तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एसएमएनपीसी) के लिए NGN2 दृष्टिकोण लागू किया और एक लाइव-सेल स्वचालित न्यूराइट आउटग्रोथ परख की स्थापना की। हम नियमित हिप्ससी संस्कृति और कॉर्टिकल और डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स में भेदभाव के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल के साथ एक स्वचालित प्रणाली पेश करते हैं। हमारा मंच उपन्यास रोग तंत्र और नशीली दवाओं के लक्ष्यों की पहचान करने के लिए दीर्घकालिक हैंड्स-फ्री कल्चर और हाई-कंटेंट/हाई-थ्रूपुट हिप्ससी बेस्ड कंपाउंड, आरएनएआई और CRISPR/Cas9 स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है ।
मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) आत्म नवीनीकरण कर रहे है और लगभग किसी भी वयस्क सेल प्रकार में अंतर कर सकते हैं । ये विशेषताएं बुनियादी अनुसंधान और दवा खोज में रोग मॉडलिंग के लिए एचआईपीएससी को एक उपयोगी उपकरण बनाती हैं1. मानव आईपीएससी दाता आनुवंशिक पृष्ठभूमि को बरकरार रखता है जो रोग-प्रासंगिक कोशिका प्रकारों को प्राप्त करने की अनुमति देता है जो रोग पाठ्यक्रम में सबसे अधिक प्रभावित/शामिल होते हैं, उदाहरण के लिए, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए विभिन्न न्यूरोनल उपप्रकार2,3। इसके अलावा, hiPSC एक मानव संदर्भ और शारीरिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में रोगों मॉडलिंग द्वारा पशु और सेलुलर अधिक अभिव्यक्ति मॉडल की सीमाओं में से कुछ पर काबू पा, और मोनोजेनिक, जटिल और एपीजेनेटिक विकारों के साथ ही देर से शुरू रोगों से लेकर रोगों मॉडलिंग में एक मूल्यवान संपत्ति साबित हो गया है4।
इन लाभों और अवसरों के बावजूद, hiPSC की कई सीमाओं को अभी भी संबोधित करने की जरूरत है । वर्तमान hiPSC संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल लागत प्रभावी नहीं हैं, मानकीकरण करने के लिए मुश्किल है और श्रम गहन हैं । मैन्युअल संस्कृति कदमों के परिणामस्वरूप विकास में अंतर और एचआईपीएससी के सहज भेदभाव के कारण पैदावार और फेनोटाइप में उच्च परिवर्तनशीलता हो सकती है। इसलिए, अधिक मानकीकृत हैंडलिंग तकनीकों को लागू करके और प्रोटोकॉल को सरल बनाकर प्रयोगकर्ता-निर्भर भिन्नता को कम करने की आवश्यकता है जिसे स्वचालन5का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। स्वचालित एचएससी संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल की स्थापना अकादमिक और औद्योगिक अनुसंधान परियोजनाओं दोनों के लिए सामान्य मानक निर्धारित करेगी, और जैविक रूप से प्रासंगिक रोग मॉडल और अधिक प्रजनन योग्य परिणामों के उत्पादन की अनुमति देगी।
पिछले काम ने एचआईपीएससी संस्कृतियों6,7,8 के स्वचालन का प्रयास किया है लेकिन उनके प्रोटोकॉल को विशिष्ट सेल संस्कृति प्लेट प्रारूपों तक सीमित कर दिया गया है जो सिस्टम पर निर्भर हैं और विभिन्न परख प्रारूपों के अनुकूलनशीलता की कमी है। इस तरह की प्रणालियां कोशिकाओं के थोक में उपयोगी होती हैं लेकिन वांछित कोशिका प्रकारों, रोग फेनोटाइपिंग और स्क्रीनिंग उद्देश्यों में स्वचालित भेदभाव के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती हैं। इसके अतिरिक्त, फाइब्रोब्लास्ट व्युत्पन्न, hiPSC पीढ़ी और भेदभाव के लिए एक बड़े पैमाने पर स्वचालित मंच9 वर्णित किया गया है, लेकिन एक पैमाने पर है कि केवल उच्च थ्रूपुट लाइनों जो आकर्षक लगता है, लेकिन कई अकादमिक प्रयोगशालाओं के लिए सस्ती हो सकता है के उत्पादन के लिए समर्पित प्रयोगशालाओं द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।
हमने एक उच्च दक्षता कण हवा (HEPA) में तरल हैंडलिंग स्टेशन के आधार पर एक पूरी तरह से स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली विकसित की है, जो बड़ी क्षमता वाले सीओ2 इनक्यूबेटर, एक ब्राइटफील्ड इमेजिंग साइटोमीटर और प्लेट परिवहन के लिए एक रोबोट आर्म के साथ मिलकर फ़िल्टर किया गया है। ये घटक स्थिर और प्रजनन योग्य एचएससी संस्कृति और भेदभाव का आधार प्रदान करते हैं। हमने सिस्टम को यौगिक या वायरस भंडारण के लिए स्वचालित -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण प्रणाली और उच्च गति वाले कताई डिस्क कॉन्फोकल लाइव-सेल इमेजर के साथ पूरित किया। कस्टम निर्मित प्रोटोकॉल स्वचालित सेल सीडिंग, मीडिया परिवर्तन, मांग जांच, सेल विस्तार और नमूना उपचार और प्लेट इमेजिंग के साथ परख प्लेट पीढ़ी की अनुमति उत्पन्न किए गए थे, जिससे सिस्टम उच्च सामग्री/उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के साथ संगत हो गया था । स्वचालित सेल कल्चर और इमेजिंग सिस्टम को कंट्रोलिंग सॉफ्टवेयर और कस्टम-मेड ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) का उपयोग करके संचालित किया जाता है। जीयूआई उपयोगकर्ताओं को विधि निष्पादन के लिए आवश्यक सेल लाइन-विशिष्ट मापदंडों वाली सीएसवी फाइलों को आयात करने की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, जीयूआई बिल्ट-इन कैलेंडर व्यू का उपयोग करके किसी भी अनुक्रम में कई प्रयोगों को शेड्यूल करने में सक्षम बनाता है, इस प्रकार प्रत्येक विधि शुरू होने पर समय का पूर्ण नियंत्रण करने की अनुमति देता है।
हमारी स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली विभिन्न प्लेट प्रारूपों (96-, 48-, 24-, 12-, 6-या 1-अच्छी प्लेट प्रारूप) में संस्कृति कोशिकाओं के लचीलेपन के साथ मानकीकृत पाइपिंग गति, पासिंग टाइम, कन्फ्यूशियस थ्रेसहोल्ड, सीडिंग घनत्व, और मध्यम मात्रा का उपयोग करती है। हमने हिप्ससी को न्यूरॉन्स में बदलने के लिए हाल ही में प्रकाशित अल्पकालिक भेदभाव प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जो 6 दिनों में TUBB3 सकारात्मक न्यूरॉन्स प्राप्त कर सकता है10,11। हमने छोटे अणु तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एसएमएनपीसी) के स्वचालित भेदभाव और इमेजिंग को न्यूरॉन्स में स्थापित किया, जो EF1a प्रमोटर12 और आईपीएससी के तहत जीएफपी को मिडब्रेन डोपामिनेर्गिक (एमडीए) न्यूरॉन्स में व्यक्त करते हैं, जो पहले प्रकाशित दोहरे-SMAD अवरोध प्रोटोकॉल13 को अनुकूलित करते हैं जो 65 दिनों के भीतर एमडीए न्यूरॉन्स की पैदावार करता है।
हम हिप्ससी संस्कृति और न्यूरोनल भेदभाव के मानकीकरण के लिए एकीकृत इमेजिंग क्षमताओं के साथ एक स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली पेश करते हैं। न्यूनतम उपयोगकर्ता हस्तक्षेप के कारण, प्रयोगात्मक भिन्नता भेदभाव के दौरान सेलुलर फेनोटाइप की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने में कम है। कैलेंडर-आधारित शेड्यूलर संगठन और प्रयोगों के समानांतरीकरण का समर्थन करता है और उच्च स्तर के लचीलेपन की अनुमति देता है जिस समय प्रयोग किए जाते हैं। मौजूदा तरीकों को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है और उपलब्ध तरीकों के स्पेक्ट्रम को बढ़ाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, परख प्लेट प्रारूपों की एक बड़ी संख्या इस प्रणाली के लचीलेपन को जोड़ने का इस्तेमाल किया जा सकता है । न्यूनतम प्रणाली जिसमें सीओ2 इनक्यूबेटर, एक रोबोटिक आर्म, एक ब्राइटफील्ड सेल साइटोमीटर और एक तरल हैंडलिंग स्टेशन शामिल है, जो अकादमिक अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए सस्ती लागत के साथ हिप्ससी संस्कृति और भेदभाव के लिए आवश्यक बुनियादी इकाई बनाती है। यौगिकों, आरएनएआई पुस्तकालयों या CRISPR/Cas9 पुस्तकालयों के भंडारण के लिए एक स्वचालित -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण प्रणाली के साथ स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली का संयोजन, और एक उच्च सामग्री/उच्च-थ्रूपित माइक्रोस्कोप के एकीकरण से फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग का निष्पादन सक्षम होता है ।
वर्तमान अध्ययन में, स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली डिस्पोजेबल सुझावों का इस्तेमाल किया और संस्कृति मीडिया जलाशय में मैन्युअल रूप से भर दिया गया था, इस प्रकार मीडिया परिवर्तन और अंय संस्कृति प्रक्रियाओं के लिए तरल हैंडलिंग स्टेशन के उपयोग को सीमित विशेष रूप से रातोंरात । इस सीमा को दरकिनार करने के लिए, तरीकों को डिस्पोजेबल युक्तियों के बजाय सुई के उपयोग में समायोजित किया जा सकता है और, फ्रिज में संग्रहीत मीडिया लाइनों और मीडिया बैग के बीच ट्यूब कनेक्शन स्थापित करने के बाद, मीडिया जलाशयों को स्वचालित रूप से ताजा मीडिया के साथ फिर से भरा जा सकता है जो हीटर तत्वों द्वारा पूर्व-गरम होता है। इससे टिप्स, कल्चर मीडिया और जलाशय एक्सचेंजों के मैनुअल रिफिलिंग के कारण उपयोगकर्ता हस्तक्षेप कम हो जाएगा ।
हमारी स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली कई फायदे प्रदान करती है। इनमें से एक बारकोड ट्रैकिंग सिस्टम है। सिस्टम में भरी हुई प्लेटों की पहचान एक अद्वितीय बारकोड द्वारा की जाती है जिसे विधि निष्पादन के दौरान और बाद में नमूनों की ट्रैकिंग की अनुमति देने वाली प्रणाली द्वारा पढ़ा और सहेजा जाता है। एक और लाभ उपयोगकर्ता विशिष्ट परियोजनाओं को बनाने की संभावना है। यहां, सिस्टम में लोड की गई संस्कृति प्लेटों को एक विशिष्ट परियोजना को सौंपा जा सकता है और बैचों में समूहित किया जा सकता है। बैचों में संरचना एक निश्चित बैच की सभी प्लेटों के लिए एक ही प्रक्रिया के निष्पादन को सरल बनाती है क्योंकि किसी भी व्यक्तिगत प्लेटों का चयन करने की आवश्यकता नहीं है। इसके अतिरिक्त, एक तरल वर्ग संपादक प्रत्येक तरल हस्तांतरण चरण के लिए पाइपिंग गति और ऊंचाई के साथ-साथ आकांक्षा और वितरण मापदंडों को समायोजित करने की अनुमति देता है। हर प्रक्रिया लॉग फ़ाइलों में प्रलेखित है जो कार्य एक दिया संस्कृति या परख प्लेट के लिए प्रदर्शन किया गया है वापस जाना करने की अनुमति ।
मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) से प्राप्त न्यूरॉन्स और अन्य सेल प्रकार विशिष्ट रोगी आबादी में न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के तंत्र का अध्ययन करने के लिए विट्रो उपकरणों में उपयोगी होते हैं (जैसे पार्किंसंस रोग के लिए डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स) व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग के लिए संभावना प्रदान करते हैं। खेती hiPSC बहुत समय गहन है और जटिल भेदभाव प्रोटोकॉल, आमतौर पर कम पैमाने पर उत्पादन तक ही सीमित निष्पादित करने के लिए प्रशिक्षित लोगों की मांग । हमने एक स्वचालित संस्कृति के लिए एचआईपीएससी की फीडर-मुक्त संस्कृति को अनुकूलित किया और दो न्यूरोनल भेदभाव प्रोटोकॉल, एक टेट-ऑन प्रमोटर10, 11केतहत एनजीएन2 ओवर-एक्सप्रेशन पर आधारित एक रैपिड कॉर्टिकल न्यूरॉन विभेदन प्रोटोकॉल और मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन्स13के उत्पादन के लिए एकदीर्घकालिकछोटे अणु आधारित प्रोटोकॉल को लागू किया। मैनुअल संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल की सीधी हस्तांतरण और प्रजनन क्षमता स्वचालित संस्कृति प्रणाली को बहुत उपयोगी बनाती है। मानव आईपीएससी स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली में सुसंस्कृत लगातार स्टेम सेल आकृति विज्ञान दिखाया और महत्वपूर्ण pluripotency मार्कर, स्वतंत्र प्रयोगों के बीच प्रजनन व्यक्त किया । इसके अलावा, हिप्ससी संस्कृति प्रोटोकॉल के स्वचालन ने समानांतर रूप से बड़ी संख्या में सेल लाइनों की संस्कृति और विस्तार का पक्ष लिया। स्वचालित मांग जांच रातोंरात किए जाने वाले समय को बचाया जाता है, जब उपयोगकर्ता प्रयोगशाला में होता था (उदाहरण के लिए, कोशिकाओं की कटाई या भेदभाव के लिए मैनुअल रिप्लेटिंग)। उपयोगकर्ता-परिभाषित संगम सीमा तक पहुंचने पर, कोशिकाओं को स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली के स्टैकर पर उपलब्ध एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों में स्थानांतरित और फिर से लेपित किया जाता है। प्रत्येक मार्ग दौर के बारे में ७० मिनट लेता है और एक माता पिता की थाली है, जो एक दिन में 20 मार्ग की क्षमता के लिए अनुवाद से चार 1 अच्छी तरह से प्लेटें उत्पन्न करता है ।
NGN2 भेदभाव प्रोटोकॉल का स्वचालन सफलतापूर्वक किया गया था और विभिन्न मार्गों में न्यूरोनल कोशिकाओं की एक सजातीय आबादी के उत्पादन की अनुमति दी गई थी और मैनुअल भेदभाव के बराबर थी। इसके अलावा, बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग अध्ययन के लिए प्रायोगिक लागत कई सेल लाइनों या परीक्षण शर्तों के हजारों के साथ स्क्रीनिंग प्रयोगों/यौगिकों तेजी से अंतर के कारण कम हो जाएगा । लाइव-सेल न्यूट्राइट आउटग्रोथ मापन सहित लागत प्रभावी और उच्च-थ्रूपुट रीडआउट को रोग मॉडलिंग के लिए फेनोटाइपिक रीडआउट के रूप में आसानी से विकसित, लागू और उपयोग किया जा सकता है, जैसा कि पहले14,15,16दिखाया गया था। इस प्रकार, हमने छोटे अणु व्युत्पन्न तंत्रिका अग्रदूत (एसएमएनपीसी) कोशिकाओं का उपयोग करके एनजीएन2 प्रोटोकॉल को और अनुकूलित किया जो ओवर-एक्सप्रेस जीएफपी का गठन करते हैं। SMNPC कोशिकाओं संस्कृति मीडिया के साथ कम लागत सहित आगे लाभ प्रदान करते है (आईपीएससी संस्कृति के साथ लागत का एक तिहाई) और समय के लिए प्रयोगों को पैमाने पर आवश्यक है । एसएमएनपीसी से सेल की पैदावार आईपीएससी के साथ प्राप्त की तुलना में 7 से 10 गुना अधिक होती है। अंतर न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक निगरानी और मैनुअल एंटीबॉडी धुंधला या रासायनिक लेबलिंग की आवश्यकता के बिना एक पूरी तरह से स्वचालित इमेजिंग प्रक्रिया का उपयोग कर कई दिनों के लिए छवि, लागत और समय की बचत खुद के द्वारा इमेजिंग सहित मैनुअल प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक थे । एक ९६ के भीतरी ६० कुओं की वर्तमान इमेजिंग अच्छी तरह से थाली प्रति 16 मिनट लेता है जब प्रति अच्छी तरह से 25 क्षेत्रों छवि रहे हैं, जिसका अर्थ है कि एक इमेजिंग के लिए डेटा १००० यौगिकों के लिए स्क्रीनिंग आधारित है, का अधिग्रहण किया जा सकता है और एक दिन में विश्लेषण किया । भविष्य में, इस readout न्यूराइट आउटग्रोथ दोषों के बचाव के लिए यौगिक स्क्रीनिंग अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इसके अलावा, हम आईपीएससी से मिडब्रेन डोपामिनेर्गिक (एमडीए) न्यूरॉन्स पैदा करने के लिए एक मैनुअल भेदभाव प्रोटोकॉल के हस्तांतरण को भी प्रदर्शित करते हैं। इस छोटे से अणु आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल में 65 दिन लगते हैं और कई रिफ्लेटिंग चरणों और लगातार मीडिया परिवर्तनों के कारण श्रम गहन है, ज्यादातर हर 2 दिन, जो एक ही समय में कुछ आईपीएससी लाइनों के लिए एमडीए न्यूरॉन्स के उत्पादन को सीमित करता है। स्वचालित एमडीए भेदभाव प्रोटोकॉल में दर्जनों आईपीएससी लाइनों के भेदभाव को स्केलिंग करने का बड़ा लाभ है। 30 सेल लाइनों को समानांतर रूप से अलग किया जा सकता है। चूंकि भेदभाव ज्यादातर मीडिया परिवर्तनों पर आधारित है, इसलिए लगभग पूरी भेदभाव प्रक्रिया मानव हस्तक्षेप के बिना आयोजित की जा सकती है। स्वचालित प्रणाली के कैलेंडर-आधारित शेड्यूलर का उपयोग करके, हम भेदभाव चरणों के अनुसार मीडिया परिवर्तनों की योजना बना सकते हैं। सेल लाइनों और संस्कृति प्लेटों की इतनी बड़ी संख्या के साथ काम करने की एक सीमा रातोंरात मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करने के लिए असंभव था । मुख्य कारण यह है कि हमारी प्रणाली डिस्पोजेबल युक्तियों और संस्कृति मीडिया के मैनुअल रिफिलिंग का उपयोग करने के लिए स्थापित की गई है, जिसमें इस मैनुअल चरण को निष्पादित करने के लिए प्रयोगशाला में उपयोगकर्ता की आवश्यकता होती है। मीडिया परिवर्तन प्रक्रिया को सुगम बनाने के लिए, सिस्टम में भरी हुई प्लेटों को एक परियोजना को सौंपा गया था और बैचों में समूहित किया गया था । बैच आकार तो डिस्पोजेबल सुझावों और उपलब्ध संस्कृति मीडिया की मात्रा की संख्या के लिए अनुकूलित किया गया था । जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, इस सीमा को पुन: प्रयोज्य/धोने योग्य सुइयों और मीडिया के स्वचालित रिफिलिंग के कार्यान्वयन से आसानी से दूर किया जा सकता है । कोशिकाओं की स्वचालित पासेजिंग/रिफ्लैटिंग, जैसा कि आईपीएससी के लिए दिखाया गया है, हमारे स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली द्वारा प्रदान की जाने वाली सुविधाओं में से एक है । हमने भेदभाव के दिन 25 पर एमडीए न्यूरॉन्स के स्वचालित रिप्लेटिंग का परीक्षण किया है। हालांकि, एमडीए न्यूरॉन्स के वियोजन के लिए आईपीएससी (8 मिनट) की तुलना में वियोजन एंजाइम के साथ इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है जो स्वचालित रिप्लेटिंग प्रक्रिया को 1 घंटे प्रति सेल लाइनों से अधिक तक बढ़ाता है। नतीजतन, एक ही दिन में 30 सेल लाइनों की स्वचालित रिप्लेटिंग असंभव हो गई। स्वचालित रिप्लेटिंग (प्लेटों का परिवहन, पाइपिंग) के दौरान अन्य चरणों को तेज करना और सिस्टम को सुइयों और मीडिया लाइन के उपयोग के लिए अनुकूल बनाना जो एक रात भर काम संभव बनाता है, इस सीमा को हल करेगा। कमियों के बावजूद, हम सफलतापूर्वक एमएपी 2 (न्यूरॉन) और टीएच (एमडीए न्यूरॉन्स) सकारात्मक कोशिकाओं की पर्याप्त मात्रा के साथ संस्कृतियों का उत्पादन एमडीए न्यूरॉन्स के एक स्वचालित भेदभाव के लिए मैनुअल प्रोटोकॉल हस्तांतरण सकता है।
समानांतर में आईपीएससी सेल लाइनों के दर्जनों अंतर परियोजनाओं में बहुत रुचि है कि पार्किंसंस रोग सहित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के आणविक तंत्र की जांच है । हालांकि, कम त्रुटियों के साथ तेजी से कार्यों को पूरा करने के लिए और कम लागत पर एक बड़ी चुनौती है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल (आईपीएससी, एसएमएनपीसी और एमडीए न्यूरॉन) के स्वचालन के कारण, हम अपनी परियोजनाओं में तेजी, लागत को कम और प्रजनन क्षमता में वृद्धि कर सकते हैं। सैकड़ों रोगी सेल लाइनों को शामिल करते हुए फाउंडिन-पीडी (https://www.foundinpd.org/wp/) जैसी परियोजनाओं के विकास से स्वचालित संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। हमारे भविष्य के दृष्टिकोण में स्वचालित प्रणाली में मैनुअल 3 आयामी (3 डी) सेल संस्कृति मॉडल का हस्तांतरण शामिल है। प्लेट परिभाषा सेटिंग्स में मामूली अनुकूलन और एडाप्टर के उपयोग से 3डी संस्कृतियों के लिए आवश्यक वाणिज्यिक या कस्टम-निर्मित प्लेटों और माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों के उपयोग की अनुमति होगी। इसके अलावा, एक स्वचालित लेबल मुक्त इमेजिंग मॉडल के कार्यान्वयन से हमें वास्तविक समय में न्यूरोनल विकास को ट्रैक करने और रोग तंत्र की बेहतर समझ में न्यूराइट आउटग्रोथ, न्यूरॉन संगठन और सेल मृत्यु में परिवर्तन का अनुवाद करने की अनुमति मिलेगी।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों कृतज्ञता रोगियों और उनके परिवारों को जो इस अध्ययन के लिए जैव सामग्री का योगदान स्वीकार करते हैं । अध्ययन में इस्तेमाल की जाने वाली कोशिकाएं एनआईएनडीएस संग्रह से रटगर्स (ND41865 आईपीएस #1 के रूप में) और डॉ तिल्लो कुनाथ (आईपीएस #2) की प्रयोगशाला से थीं । इस काम को नोमिस फाउंडेशन (पीएच), रिमोड-एफटीडी, यूरोपीय संघ के संयुक्त कार्यक्रम – न्यूरोडीजेनेरेटिव डिजीज रिसर्च (जेपीएनडी) (पीएच) द्वारा समर्थित किया जाता है; DZNE I2A पहल (विज्ञापन); पीडी-स्ट्रैट, एक युग-नेट ERACoSysMed वित्त पोषित परियोजना (पीएच) और पार्किंसंस रोग (फाउंडिन-पीडी) (पीएच, ईबी) के लिए मूलभूत डेटा पहल । फाउंडिन-पीडी पीडी कार्यक्रम के लिए माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन के पथ का हिस्सा है । लेखकों ने स्टीवन फिंकबेनर और मेलानी Cobb (ग्लैडस्टोन संस्थानों) को मैनुअल एमडीए न्यूरॉन विभेदन प्रोटोकॉल और महोमी सुजुकी (योकोगावा इलेक्ट्रिक कॉर्पोरेशन) की स्थापना में योगदान देने के लिए न्यूराइट आउटग्रोथ विश्लेषण सेटअप में सहायता के लिए धन्यवाद दिया।
Antibodies | Distributor | Catalog Number | Dilution |
iPSC pluripotency marker | |||
Mouse anti-SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 to 33 |
Rabbit anti-Oct3/4 | Abcam | ab19857 | 1 to 200 |
NGN2 neuron markers | |||
Mouse anti- TUBB3 | R & D | MAB1195 | 1 to 500 |
Rabbit anti-BRN2 | NEB | 12137 | 1 to 1,000 |
mDA neuron markers | |||
Chicken anti-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 to 750 |
Mouse anti-MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 to 750 |
Secondary antibodies | |||
Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 to 2,000 |
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 to 2,000 |
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 to 2,000 |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 to 2,000 |
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 to 2,000 |
Nuclei counterstaining | |||
Hoechest 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 to 8,000 |
Instruments | Distributor | Catalog Number | Description/Application |
Agilent TapeStation system | Agilent technologies | 4200 | Automated electrophoresis for DNA and RNA samples |
Automated -20 °C storage system | Hamilton Storage Technologies |
Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series) |
Storage of reagents |
Barcode reader | Honeywell | Barcode Reader Orbit | Barcode scanner |
Brightfield cell cytomat | Nexcelom | Celigo | Confluence check and cell counting |
CellVoyager 7000 | Yokogawa | CellVoyager 7000 | Automated confocal microscope |
Cytomat for cell cultures | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 24 C, CU | 12 stackers pitch 28 mm, 12 stackers pitch 23 mm (total of 456 plates) |
Cytomat for thawing samples | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU (Drying Unit) |
2 stackers pitch 28 mm (total of 42 plates) |
HEPA filters | Hamilton Robotics | Hood Flow Star UV | Modified by Hamilton Robotics |
Liquid handling station | Hamilton Robotics | Microlab Star | Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml and 96 Channel MPH |
Media reservoir | Hamilton Robotics | 188211APE | Media/reagents reservoir |
Pure water system | Veolia Water | ELGA PURELAB Classic | Provides pure water for needle wash station |
QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System |
Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | Real-time PCR machine |
Robotic arm | Hamilton Robotics | Rackrunner | Transport of plates |
Turn table | Hamilton Robotics | Turn Table | Adjust plate orientiation |
Uninterruptible power supply | APC | Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power supply |
Backup power supply |
VIAFLO-pipettes | Integra | 4500 | Electronic pipette |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4453545 | Real-time PCR machine |
Materials | Distributor | Catalog Number | Notes |
1-well culture plate (84 cm2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
6-well culture plates (9.6 cm2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC treated with lid |
12-well culture plate (3.9 cm2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC treated with lid |
96-well culture plate (0.32 cm2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 Black plate |
Tips, 50-µL | Hamilton Robotics | 235987 | 50-uL tips |
Tips, 300-µL | Hamilton Robotics | 235985 | 300-µL tips |
Tips, 1000-µL | Hamilton Robotics | 235939 | 1000-µL tips |
Tips, 5-mL | Hamilton Robotics | 184022 | 5-mL tips |
Tubes, 15-mL | Greiner Bio-One | 188271 | 15-mL tubes |
Tubes, 50-mL | Greiner Bio-One | 227261 | 50-mL tubes |
Nalgene cryogenic 2.0 mL vials | Sigma Aldrich | V5007 | Cryovials |
Plasmids | Distributor | Catalog Number | Notes |
pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Kind gift from Ron Weiss |
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Kind gift from Ron Weiss |
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus | Takara Bio | 631983 | |
Primers | Sequence (forward) | Sequence (reverse) | Source |
iPSC pluripotency | |||
OCT4 (ID 4505967a1) | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC | PrimerBank |
NANOG (ID 153945815c3) | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | PrimerBank |
REX1 (ID 89179322c1) | AGAAACGGGCAAAGACAAGAC | GCTGACAGGTTCTATTTCCGC | PrimerBank |
NGN2 neurons | |||
MAP2 (ID 87578393c1) | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCGCTTCGGACAAG | PrimerBank |
BRN2 (ID 380254475c1) | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
CUX2 (ID 291045458c2) | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | PrimerBank |
NCAM1 (ID 336285437c3) | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAGTGCCCTC | PrimerBank |
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) | TGCTCAGCAGTACAACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
mDA neurons | |||
TH | CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA | CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA | NCBI primer-BLAST |
MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGCTACAGCCTCA | NCBI primer-BLAST |
Housekeeping genes | |||
GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCTTCTCCATG | NCBI primer-BLAST |
OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCG | NCBI primer-BLAST |
RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI primer-BLAST |
RPL13A | GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC | TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC | NCBI primer-BLAST |
Media and Reagents | Distributor | Catalog Number | Use concentration |
Coating matrix | |||
Extracellular matrix (Matrigel) | Corning | 354277 | 10 μg/mL |
Fibronectin | Corning | 356008 | 2 μg/mL |
Laminin | Sigma | L2020 | 5 – 10 μg/mL |
Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | P3655 | 0.1 mg/mL |
Culture media | |||
iPSC culture medium (Essential 8 Flex medium) |
Gibco | A2858501 | |
NGN2 neurons – NGN2 medium | |||
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.909 mL (50 µM) |
B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (1%) |
DMEM/F-12, GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484.75 mL |
GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL ( 2 mM) |
Insulin | Sigma | I9278 | 0.25 mL (2.5 µg/mL) |
MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (0.5%) |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (0.5%) |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
mDA neurons – SRM medium | |||
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 0.5 mL (55 µM) |
GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409.5 mL |
Knockout serum replacement (serum replacement) |
Gibco | 10828028 | 75 mL (15%) |
MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | 5 mL (1%) |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
mDA neurons – N2 medium | |||
B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 mL (2 mM) |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | 5 mL (1%) |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 475 mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL(1%) |
mDA neurons – Differentiation medium | |||
B27 supplement | Gibco | 12587010 | 10 mL (2%) |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | 485 mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 5 mL (1%) |
NGN2 neurons – Supplements | |||
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 10 ng/mL |
CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 2 μM |
Doxycyline (dox) | Sigma | D9891 | 2.5 μg/mL |
Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (AA2) |
Sigma | A8960 | 64 mg/L |
Neurotrophic factor-3 (NT-3) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL |
Purmorphamine (PMA) | Cayman | 10009634 | 0.5 μM |
Puromycin | Sigma | P8833-10MG | 0.5 μg/mL |
Thiazovivin | Merk Millipore | 420220-10MG | 2 μM |
mDA neurons – Supplements | |||
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) |
Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
CHIR99021 (CHIR) | R&D | 4423/10 | 3 μM |
DAPT | Cayman | 13197 | 10 µM |
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | 1 mM |
Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) | Peprotech | 100-25 | 100 ng/mL |
Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) |
Peprotech | 450-10 | 20 ng/mL |
L-ascorbic acid (AA1) | Sigma | A4403 | 0.2 mM |
LDN193189 (LDN) | Cayman | 11802 | 100 nM |
Purmorphamine (Purm) | Cayman | 10009634 | 2 μM |
Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH) |
R&D | 1845-SH | 100 ng/mL |
SB431542 (SB) | Cayman | 13031 | 10 μM |
Transforming Growth Factor type ß3 (TGFß3) |
R&D | 243-B3 | 1 ng/mL |
Y-27632 | Cayman | 10005583 | 10 µM |
Dissociation reagents | |||
Single cell dissociation reagent (StemPro Accutase) |
Gibco | A1110501 | 1x |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Gibco | 11575020 | 0.5 mM |
RNA isolation and cDNA kit | |||
RNA isolation kit | Qiagen | 74106 | Rneasy MiniKit |
RNA lysis buffer | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Trizol lysis buffer (RNA lysis buffer) |
Reverse transcriptase (kit) | Thermo Fisher Scientific | 18080-085 | SuperScript III Reverse Transcriptase |
Software | Company | Catalog Number | Description/Application |
Cell Culture Framework (CCF) (Graphical user interface, GUI) |
Hamilton Robotics | Custom-made | User interface for the automated system |
CellPathFinder software (image analysis software 1) |
Yokogawa | CellPathfinder HCS Software | Image analysis tool |
CellVoyager Measurement System | Yokogawa | Included with CellVoyager 7000 |
Microscope controlling software |
Columbus software (image analysis software 2) |
Perkin Elmer | Columbus | Image analysis tool |
Cloud based qPCR app | Thermo Fisher Scientific | Themo Fisher cloud | Analysis software for qRT-PCR data |
Venus software | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software |
Controlling software for the automated system |