Automatisert produksjon av humane induserte pluripotente stamcelleavledede kortikale og dopaminerge nevroner med integrert live-celle overvåking

Summary

Vi viser automatisering av menneskelige induserte pluripotente stamcellekulturer (hiPSC) og nevronal differensieringer som er kompatible med automatisert bildebehandling og analyse.

Abstract

Manuell kultur og differensieringsprotokoller for humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC) er vanskelige å standardisere, vise høy variasjon og er utsatt for spontan differensiering i uønskede celletyper. Metodene er arbeidskrevende og er ikke lett mottagelige for store eksperimenter. For å overvinne disse begrensningene utviklet vi et automatisert cellekultursystem koblet til et bildesystem med høy gjennomstrømning og implementerte protokoller for å opprettholde flere hiPSC-linjer parallelt og nevronal differensiering. Vi beskriver automatiseringen av en kortsiktig differensieringsprotokoll ved hjelp av Neurogenin-2 (NGN2) overuttrykk for å produsere hiPSC-avledede kortikale nevroner innen 6\u20128 dager, og implementeringen av en langsiktig differensieringsprotokoll for å generere hiPSC-avledede midbrain dopaminerge (mDA) nevroner innen 65 dager. Vi brukte også NGN2-tilnærmingen på en liten molekylavledet nevrale forløperceller (smNPC) transdusert med GFP lentivirus og etablerte en live-celle automatisert neuritt utvekstanalyse. Vi presenterer et automatisert system med protokoller egnet for rutinemessig hiPSC kultur og differensiering i kortikale og dopaminerge nevroner. Vår plattform er egnet for langsiktig håndfri kultur og høy-innhold / høy gjennomstrømning hiPSC-baserte sammensatte, RNAi og CRISPR / Cas9 screenings for å identifisere nye sykdomsmekanismer og narkotikamål.

Introduction

Humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC) er selvfornyende og kan differensiere i nesten alle voksne celletyper. Disse egenskapene gjør hiPSC til et nyttig verktøy for sykdomsmodellering i grunnleggende forskning og narkotikaoppdagelse¹. Human iPSC beholder donorgenetisk bakgrunn som gjør det mulig å utlede sykdomsrelevante celletyper som er mest berørt / involvert i sykdomsforløpet, for eksempel forskjellige nevronale undertyper for nevrodegenerative^{sykdommer 2,3}. HiPSC overvinner også noen av begrensningene i dyre- og cellulære overuttrykksmodeller ved å modellere sykdommer i menneskelig sammenheng og fysiologiske proteinuttrykksnivåer, og har vist seg å være en verdifull ressurs i modellering av sykdommer som spenner fra monogene, komplekse og epigenetiske lidelser, samt sene sykdommer⁴.

Til tross for disse fordelene og mulighetene, må flere begrensninger av hiPSC fortsatt tas opp. Nåværende hiPSC-kultur- og differensieringsprotokoller er ikke kostnadseffektive, vanskelige å standardisere og er arbeidsintensive. Manuelle kulturtrinn kan føre til høy variasjon i utbytter og fenotyper på grunn av forskjeller i vekst og spontan differensiering av hiPSC. Derfor må eksperimenteringsavhengig variasjon reduseres ved å implementere mer standardiserte håndteringsteknikker og forenkle protokoller som kan oppnås ved hjelp av automatisering⁵. Etableringen av automatisert hiPSC kultur og differensiering protokoller vil sette felles standarder for både akademiske og industrielle forskningsprosjekter, og tillate generering av biologisk relevante sykdomsmodeller og mer reproduserbare resultater.

Tidligere arbeid har forsøkt automatisering av hiPSC^{kulturer 6,7,}8 men^{deres protokoller} har vært begrenset til bestemte celle kultur plate formater avhengig av systemet og mangler tilpasningsevne til ulike analyseformater. Slike systemer er nyttige i sveising av celler, men kan ikke være egnet for automatisert differensiering i ønskede celletyper, sykdomphenotyping og screeningformål. I tillegg har en storskala automatisert plattform for fibroblastavledning, hiPSC-generering og differensiering blitt^{beskrevet 9,} men på en skala som bare kan oppnås ved høy gjennomstrømningslaboratorier dedikert til produksjon av linjer som virker attraktive, men kan være uoverkommelige for mange akademiske laboratorier.

Vi utviklet et helautomatisk cellekultursystem basert på en væskehåndteringsstasjon i et høyeffektivt partikkelluft (HEPA)-filtrert miljø sammen med en storkapasitets CO 2-inkubator, et brightfield imaging cytometer og en robotarm for platetransport. Disse komponentene gir grunnlag for stabil og reproduserbar hiPSC-kultur og differensiering. Vi supplerte systemet med et automatisert -20 ° C lagringssystem for sammensatt eller viruslagring og en høyhastighets spinnende disk confocal live-cell imager. Skreddersydde protokoller ble generert slik at automatisert cellesåing, medieendringer, samløpet sjekker, celleutvidelse og analyseplategenerering med prøvebehandling og plateavbildning, noe som gjør systemet kompatibelt med høyinnhold / høy gjennomstrømningsscreening. Det automatiserte cellekultur- og bildesystemet drives ved hjelp av kontrollerende programvare og det skreddersydde grafiske brukergrensesnittet (GUI). Gui lar brukerne importere CSV-filer som inneholder cellelinjespesifikke parametere som trengs for metodekjøring. I tillegg gjør GUI det mulig å planlegge mange eksperimenter i en hvilken som helst rekkefølge ved hjelp av den innebygde kalendervisningen, slik at full kontroll over tiden når hver metode starter.

Vårt automatiserte cellekultursystem bruker standardiserte pipetteringshastigheter, passagingstider, samløpetsterskler, såetettheter og middels volumer med fleksibilitet til kulturceller i en rekke plateformater (96-, 48-, 24-, 12-, 6- eller 1-brønns plateformat). Vi tilpasset en nylig publisert kortsiktig differensieringsprotokoll for å konvertere hiPSC til nevroner som kan gi TUBB3 positive nevroner i 6 dager^10,11. Vi etablerte også den automatiserte differensiasjonen og avbildningen av små molekylnerale forløperceller (smNPC) til nevroner som uttrykker GFP under EF1a promoter¹² og iPSC i midbrain dopaminerge (mDA) nevroner, og tilpasser en tidligere publisert dual-SMAD hemmingsprotokoll¹³ som gir mDA nevroner innen 65 dager.

Protocol

1. Grunnleggende prosedyrer for automatisering av cellekulturer og bildebehandling Last nye kulturplater og tips Åpne GUI og klikk på knappen Ressurs/Instrument prosessvisning. Hvis du vil kjøre en ressurs-/instrumentprosess, velger du ressurs-/instrumentprosessen og klikker på Kjør instrumentprosess-knappen. Kjør ressursprosessen RunHepaHood og Reloading (se trinn 1.1.1). Åpne døren, last cellekulturplatene og engangsspissene i tilsvarende posisjon som angitt i popup-bildet på den kontrollerende PCen. Tørk av døren med 70% etanol for dekontaminering og lukk den. Kjør instrumentprosessen Dekontaminering fra GUI (se trinn 1.1.1). Systemet steriliseres av UV-stråling i 30 min. Etterfyll kulturmedier og/eller dissosiasjonsreagens Utfør instrumenttrinnet RunHepahood (se trinn 1.1.1). Åpne inngangsdøren til væskehåndteringsstasjonen. Dekontaminere reservoarer (inneholder media, PBS og / eller dissosiasjon reagens) med 70% etanol og plassere dem på dekk til tildelt positon (som definert i cfg.csv-fil). De-lid reservoarene. Dekontaminer døren med 70% etanol og lukk den. Slå av HEPA-hetten ved å kjøre ressurs-/instrumentprosessen “InitHepaHood” fra GUI. Opprette en ny “Cellelinje” og prosjekt i GUI Opprette/endre de brukerdefinerte “Cellelinje”-filene som består av Config (*.cfg.csv), importfilene (*.imp.csv), ressursen (*.rsv.csv) og arbeidsflytfilene (*.wfl.csv). Åpne GUI og opprett en ny “Cell line” ved å klikke på Legg til cellelinje knappen i “Cell line editor” visning. En veiviser åpnes der Config-filen må velges, og et prosjektnavn med en kort beskrivelse må angis. Naviger gjennom denne veiviseren ved hjelp av det grønne pilhodet og bekreft innstillingene ved å klikke på den grønne haken. Opprett et nytt prosjekt for den genererte “Cellelinjen” ved å klikke på Legg til prosjekt-knappen. Skriv inn et prosjektnavn og en beskrivelse, og definer en prosjektfarge som skal vises i kalendervisningen for GUI- Naviger til neste side i veiviseren ved å klikke pilspiss. Opprett et nytt parti ved å klikke på Legg til satsvis -knappen og gi et kort navn og en beskrivelse i popup-vinduet. Velg alle prosesstrinn, og planlegg starttiden for hvert av prosesstrinnene. Lukk vinduet ved å klikke på OK. Utføre en automatisert metode ved hjelp av GUI Gå til kalendervisningen av GUI og klikk på Legg til prosesstrinn knapp. Merk Celle-linjen, og velg prosjektet etter å ha navigert til neste side i veiviseren. Merk batchen som skal brukes, og klikk på pilhodet som peker mot høyre. Avhengig av metoden som brukes, må batchene enten være tomme (for å motta nye plater), eller inneholde kulturplater eller analyseplater (alle andre prosesser). Naviger til neste side i veiviseren, og velg prosesstrinnet som skal utføres. Gå til den siste siden i denne veiviseren, og planlegg eksperimentet. I delen “Parameterdetaljer” variabler som er nødvendige for å kjøre metoden kan endres. Bekreft ved å klikke OK. Lasting av kultur- og analyseplater i CO2-inkubatorenMERK: 1-brønnplater er definert som kulturplater siden de ofte brukes til bulkceller. Alle multi-brønnplater er definert som analyseplater. Utfør instrumentprosessen “RunHepaHood” fra GUI som beskrevet i trinn 1.1.1. og åpne døren foran robotarmen. Tørk av bunnen av analyseplatene med 70 % etanol og et lofritt vev hvis platene lastes for automatisert avbildning. Plasser kultur- eller analyseplater på venstre hylle. Kontroller at retningen på platen er riktig. For analyseplater må vel A1 peke mot robotarmen, mens kantene på kulturplatene må peke mot høyre. Tørk av døren med 70% etanol for dekontaminering og lukk den. Utfør metoden “Lasting of Culture Plates” for import av 1-brønnsplater eller “Lasting of Assay Plates” for import av multi-brønnplater som beskrevet i trinn 1.4. Bruk et tomt parti til å kjøre begge metodene. Hvis platestrekkoder allerede finnes i denne bunken, fjerner du merket for dem ved å klikke på avmerkingsboksene. Transporter individuelle plater fra hyllen til CO2 inkubatorplattformen ved hjelp av robotarmen. Den innebygde platefergenstasjonen henter platen og lagrer dem i et av stativene til CO 2-inkubatoren. Cellene opprettholdes ved 37 °C og 5 % CO2. Lossing av plater fra CO2 inkubator Utfør metoden “Losse plater” (se trinn 1.4). Velg batchen som inneholder platene som må eksporteres. Individuelle plater kan velges av sine strekkoder. Transport platene ut fra CO2-inkubatoren til venstre hylle ved hjelp av robotarmen. Start HEPA-hetten ved hjelp av instrumentprosessen “RunHepaHood” som beskrevet i trinn 1.1.1. og åpne døren foran robotarmen. Fjern platene, dekontaminer døren med 70% etanol før du lukker den og slå av HEPA-hetten. 2. Automatiseringsprotokoller Seeding av plater fra rør Start HEPA-hetten ved å utføre instrumentprosessen RunHepaHood (se trinn 1.1.1). Åpne døren foran væskehåndteringsstasjonen. Skriv inn 50 ml røret som inneholder cellefjæringen og de-lid røret. Åpne døren foran robotarmen og last belagte kulturplater for å motta celler på hyllen. Dekontaminere og lukk begge dørene. Utfør metoden “Seeding av plater fra rør” (se trinn 1.4). Telle celler på brightfield imaging cytometer ved hjelp av direkte celletelling funksjon. For celletelling, bruk 16 brønner som replikerer i et 384-brønns plateformat. Transporter telleplaten med 384 brønner fra dekk til brightfield imaging cytometer via platespilleren ved hjelp av robotarmen og start bildeprosessen. Cytometeret bestemmer automatisk cellenummeret per milliliter. Før telleplaten tilbake til sin opprinnelige posisjon ved hjelp av robotarmen. Transporter en belagt kultur eller analyseplate fra hyllen til pipetteringsdekket ved hjelp av robotarmen. Fjern belegg- og frøceller i det brukerdefinerte nummeret, og volum som passer for plateformatet (se tabell 1). Flytt platen til shakeren på dekk i 10 s ved 500 o/min for celledistribusjon og overfør til CO 2-inkubatoren. Automatisk sammenføyningsvurdering Utfør metoden “Kontroller samløpet” som beskrevet i trinn 1.4. Velg en batch som inneholder minst én kulturplate og ingen analyseplater. I avsnittet “Parameterdetaljer” inndata “iPSCf_2020” for bildeanskaffelse og bildeanalyseinnstillinger. Transporter den første platen fra CO 2-inkubatoren til brightfield imaging cytometer via platespilleren ved hjelp av robotarmen. Utfør avbildning av celler i brightfield imaging cytometer for samløpet kontroll av hiPSC kolonier. Bruk “samløpet” søknad og bilde 13 felt av 1-brønns pate og automatisk beregne gjennomsnittlig område okkupert av celler. Transporter platen tilbake til CO2-inkubatoren ved hjelp av robotarmen. Gjenta trinn 2.2.2. til 2.2.4. for de resterende platene. Medieskifte av kulturplater eller analyseplater Utfør metoden “Media Change Of Culture Plates” som beskrevet i trinn 1.4. og velg en batch som bare inneholder kulturplater. Still inn variabelen som angir om tips eller nåler brukes til pipetteringstrinnene i avsnittet “Parameterdetaljer”. For medieendring av en hvilken som helst multi-well plate, utfør metoden “Media Change Of Assay Plates” og velg en batch som inneholder analyseplater. Transporter de enkelte platene fra CO 2-inkubatoren til decket ved hjelp av robotarmen og de-lid platene. Vipp platene automatisk og aspirer gamle medier og kast det i avfallsinnsamlingsmodulen. Tilsett 12 ml ferske medier. Sett platen på plass igjen og transport platene tilbake til CO 2-inkubatoren ved hjelp av robotarmen. Subcultivation (Subcultivation)MERK: Utfør instrumentprosessen “RunHepaHood” fra GUI som beskrevet i 1.1.1. og åpne inngangsdøren til væskehåndteringsstasjonen. Legg i utskriftsmateriale og desosiasjonsreagens i de nødvendige posisjonene (se trinn 1.2). Hvis tips må fylles på nytt, bruker du “Omlasting” som beskrevet i trinn 1.1. Skriv inn et 50 ml rør for å motta cellefjæringen og de-lid røret. Utfør metoden “Subcultivation of Adherent Cells” (se trinn 1.4). Velg den satsvise gruppen som inneholder kulturplater som trenger subcultivation. Transporter platene fra CO 2-inkubatoren til dekk ved hjelp av robotarmen og de-lid platene. Vipp platene automatisk og fjern gamle medier og kast det inn i avfallsinnsamlingsmodulen. Vask celler en gang med 8 ml PBS. Legg til 8 ml 0,5 mM EDTA for klumpbasert passaging. Inkuber på dekk i 8 min. Fjern EDTA-løsningen fra platene og kast den inn i avfallsinnsamlingsmodulen. Tilsett 12 ml friskt medium og transport platene til shakeren. Rist ved 2000 rpm i 1 min for å løsne koloniene. Triturate celle suspensjon for fem sykluser av pipettering å bryte iPSC kolonier i en mindre størrelse (~ 50 \ u201280 μm). Overfør cellefjæringen til et 50 ml rør på dekk. Frøceller automatisk som beskrevet i trinn 2.1.5 ved hjelp av et delt forhold på 1 i 7.MERK: Valgfri, enkeltcellepasaging. Generer en enkelt celle suspensjon ved hjelp av en celle dissosiasjon reagens (se Table of Materials). I stedet for 0,5 mM EDTA i trinn 2.4.2., bruk 8 ml av encelledesosiasjonsreagens og inkuber i 20 min ved 37 °C. Samle cellefjæringen i et 50 ml rør og legg til like mange medier. Dissosiasjon ved hjelp av encelledissosiasjonsreagensen krever et manuelt trinn for å pellet cellene. Sentrifugeceller ved 300 x g i 3 min. Fjern den overnaturlige og resuspend cellepellet i 12 ml av de nødvendige medier og fortsett med “Seeding av plater fra rør” (se trinn 2.1). Supplere media med 2 μM tiazovivin på dagen for seeding når du bruker encelledeuspensjon av hiPSCer. Automatisert bildebehandling med høy innhold, høy gjennomstrømmingMERK: Måleinnstillingen må være tilgjengelig (se Tilleggsfil 1: trinn 1.1). Analyseplatene som skal avbildes, er tilgjengelige i inkubatoren. Utfør metoden “Imaging” (se trinn 1.4). Velg en batch som inneholder minst én analyseplate og ingen kulturplate. I avsnittet “Parameterdetaljer” angir du platetypen, platedefinisjonene (for standard 96-brønns bildeplater: “Plate-96-20170918113842”) og navnet på måleinnstillingen. Transporter analyseplaten via platespilleren til det automatiserte konfokale mikroskopet ved hjelp av robotarmen for å starte bildeprosessen. Gjenopprett platen på slutten av bildet fra mikroskopet og transporter den tilbake til CO2-inkubatoren. Gjenta prosessen med de gjenværende platene i batchen. 3. Automatisert vedlikehold og utvidelse av hiPSC Sekvensen av automatiserte samløpet sjekker, medieendringer og subcultivation Frøceller på 1-brønnsplater ved hjelp av “Seeding av plater fra rør” -metoden (se trinn 2.1). Alternativt kan du importere manuelt seedede 1-brønnsplater ved hjelp av metoden “Lasting av kulturplate” (se trinn 1.5). Planlegg automatisert samløpet sjekker daglig for å overvåke kolonivekst fra dag 1 til dag 6 av kulturen for iPSC (se trinn 2.2). Oppdater medier annenhver dag ved hjelp av metoden “Medieendring av kulturplater” (se trinn 2.3). 12 ml medium brukes per plate. På dag 6 starter du prosessen “Subcultivation” (se trinn 2.4.). 4. Automatisert differensiering Human iPSC til kortikale NGN2 nevronerMERK: Manuell hiPSC-klargjøring. Protokollen innebærer overuttrykk av NGN2 ved hjelp av lentiviral vektorer for levering. Transduser hiPSC med NGN2 til rTTA3 lentivirus i et forhold på 1:2 (> ~107 TU/ml). Celler velges deretter for en passasje med 0,5 μg / ml puromycin. En detaljert protokoll for generering av stabile hiPSC-NGN2 linjer er i supplerende fil 1:trinn 2. Fortsett med “Subcultivation”-prosessen som beskrevet ved hjelp av encelledissosiasjonsreagensen som er beskrevet i note trinn 2.4.4. når hiPSC når 70 \\ u201280% samløpet Fjern den overnaturlige og resuspend cellepellet i 12 ml NGN2 media (Table of Materials) som inneholder 2,5 μg / ml doxycyklin (dox) og 2 μM tiazovivin. Start differensiering ved hjelp av metoden “Seeding of plates fromtubes” (se trinn 2.1). Still inn ønsket såetetthet av iPSC til 30 000/cm2 (se tabell 1). IPSC er belagt på forhåndsbelagte plater med 0,1 mg/ml poly-L-ornitin (PLO) og 5 μg/ml laminin.MERK: 1-brønnsplater foretrekkes for RNA- og proteomikkbaserte studier, mens 96-brønnsplateformatet foretrekkes for bildeeksperimenter. Andre analyseplateformater som 48-, 24-, 12- eller 6-brønnsplater kan også brukes. På dag 1 av differensiering, Oppdater medier ved hjelp av “Media endring av analyseplater (se trinn 2.3) ved hjelp av NGN2 medium, supplert med 2,5 μg/ml dox og 10 μM N-[2S-(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-fenyl-glycin, 1,1-dimethylethyl ester (DAPT). Fortsett med medieendringer hver 2\u20123 til ønsket differensieringsdag (se trinn 2.3). På dag 4 av differensiering, utfør en annen medieendring (se trinn 2.3.) ved hjelp av NGN2 medium supplert med 10 ng /ml hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF), 10 ng/ml glialcelleavledet nevrotrofisk faktor (GDNF) og 10 ng/ml nevrotrofisk faktor 3 (NT-3) for å forbedre modningen. På slutten av eksperimentet eksporterer du kulturplatene fra systemet for nedstrøms eksperimenter (se trinn 1.6). Små molekyl nevrale forløperceller (smNPC) til NGN2 nevronerMERK: Utlede smNPC etter den tilpassede versjonen av den publiserte protokollen12 (se Tilleggsfil 1: trinn 5). Endre smNPC med NGN2 og rTTA3 virus (se Supplerende fil 1: trinn 2). En runde NGN2 og rTTA-transduksjon er tilstrekkelig til å generere en stabil befolkning. Ytterligere endre smNPC med pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus slik at du kan utføre live-celle overvåking. Et mangfold av infeksjon (MOI) på 10 brukes til GFP lentiviral transduksjon. Passasje smNPC på å nå samløpet ved hjelp av encelledevesosiasjonsreagens som beskrevet i trinn 2.4. Merk. Frøceller ved hjelp av det automatiserte cellekultursystemet med en celletetthet på 50 000/cm2 ved hjelp av metoden “Seeding of plates from tubes” (se trinn 2.1.) på forhåndsbelagte plater med 0,1 mg/ml PLO, og 5 μg/ml laminin i NGN2 medium supplert med 2,5 μg/ml dox. På dag 3 utfører du en medieendring (se trinn 1.3.) ved hjelp av friskt NGN2-medium som inneholder 2,5 μg/ml dox og 10 μM DAPT. Etter dag 3 utfører du medieendringer hver tredje dag med et friskt NGN2-medium som inneholder 2,5 μg/ml dox, BDNF, GDNF og NT-3 ved 10 ng/ml hver. Bildeceller daglig ved hjelp av metoden “Automatisert høyt innhold, høy gjennomstrømming” (se trinn 2.5) for å overvåke differensieringsstatus ved hjelp av GFP som avlesning for neurittutvekst. Sett lasereffekten til 80 % og bruk en eksponeringstid på 30 ms. Anskaffe et stort antall felt (f.eks. 25 felt) ved hjelp av 20x mål. Batch bildeanalyse Utfør bildeanalyse med bildeanalyseprogramvare 1 ved hjelp av neurittutvekstmalen. Åpne programvaren. Velg alternativet “Data” og bla til bildedatamappen, klikk ok for å laste inn data som skal analyseres. Klikk åpen og velg protokoll fra programmenyen, og velg neurittutvekst fra programmenyen. Gå til “algoritmer” og bruk “488” -kanalen til å definere kjernen, cellekroppen og neuritt. Juster terskelparameterne for hver. Velg brønnene som skal brukes til bildeanalyse. Nederst til høyre klikker du på linken og velg funksjoner som skal analyseres, for eksempel celletellingsgjennomsnitt, total skjelettlengde totalt. Fortsett med “pre-analyze” etterfulgt av “forhåndsvisning”. Kontroller om forhåndsvisningsinnstillingene er akseptable, og start analysen i satsvis modus. Resultatene er tilgjengelige i den overordnede mappen under “rapporter” .csv filformat som kan åpnes i Excel.MERK: Skript for bildeanalyse er tilgjengelig på forespørsel. Plot gjennomsnittlig neurite lengde oppnådd ved total neurite lengde normalisert til cellenummer. 5. Automatisert differensiering av hiPSC i midbrain dopaminerge (mDA) nevroner Manuell hiPSC-klargjøring Dissosier 70\u201280% samtidig hiPSC i enkeltceller ved hjelp av enkeltcelledissosiasjonsreagensen. Inkuber celler med encelledissosiasjonsreagens (100 μL/cm2)i 30 min ved 37 °C, samle cellesuspensjon i et konisk rør, sentrifuge ved 200 x g i 5 min og gjenoppliv cellepellet i iPSC-kulturmedium. Frø 200 000 celler/cm2 på ekstracellulære matrisebelagte 1-brønnsplater og iPSC-kulturmedium supplert med 10 μM Y-27632. Kulturceller over natten ved 37 °C og 5 % CO2. Automatisert differensiering: Fase 1 Forbered det automatiserte kultursystemet som beskrevet i trinn 1.1\u20121.2. Last kulturplater som inneholder celler inn i CO 2-inkubatoren til det automatiserte kultursystemet (se trinn 1.5). Forbered KSR medium (se Materialtabell) og supplere med små molekyler (se tabell 2) som kreves for startdag 0 differensiering. Bruk bare nyberedt media med små molekyler og vekstfaktorer. Utfør medieendringer av kulturplatene som beskrevet i trinn 2.3 på dag 0 og 1 differensiering og deretter annenhver dag til dag 25. Fra dag 5 skifter medieformuleringen gradvis som beskrevet i detalj i tabell 3. På dag 11, legg mDA neuron differensiering medium supplert med CHIR (til dag 13), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 og DAPT (se Materials tabellen). På dag 25 losseplater (se trinn 1.6.) Manuell omlegging 1 Dissosier dag 25 mDA forløpere i enkeltceller ved hjelp av enkeltcelledissosiasjonsreagensen. Kort, inkuber celler med encelledissosiasjonsreagens (100 μL/cm2)i 40 min ved 37 °C, samle cellesuspensjon i et konisk rør, sentrifuge ved 200 x g i 5 min og gjenoppliving av cellepellet i mDA neuron differensieringsmedium. Frø 400 000 celler/cm2 i 1-brønns kulturplater pre-belagt med 0,1 mg/ml PLO, 10 μg/ml laminin og 2 μg/ml fibronectin i mDA neuron differensieringsmedium supplert med 10 μM Y-27632 (til dag 26) og små molekyler og vekstfaktorer som er beskrevet i tabell 2. Kulturceller over natten ved 37 °C og 5 % CO2. Automatisert differensiering: Fase 2 Last kulturplater som inneholder mDA-nevroner inn i CO 2-inkubatoren til det automatiserte kultursystemet som beskrevet i trinn 1.5 Forbered mDA neuron differensieringsmedium (se Materialtabell) og supplere med små molekyler og vekstfaktorer som kreves for den endelige differensieringen fra dag 26 og utover (se tabell 2). Utfør medieendringer av kulturplater som beskrevet i trinn 2.3 på dag 26 av differensiering og deretter hver 3\u20124 dager til dag 65.MERK: For bildeformål med høy gjennomstrømning anbefales det å omplatee mDA-nevronene i 96-brønnplater ved lav tetthet på dag 32 av differensiering, som beskrevet i trinn 5.5. Manuell omlegging 2 Losse kulturplater som beskrevet i trinn 1.6. Dissosiere dag 32 mDA nevroner i enkeltceller som beskrevet i trinn 5.3.1. Frø 100 000 celler/cm2 i 96-brønns plater pre-belagt med 0,1 mg/ml PLO, 10 μg/ml laminin og 2 μg/ml fibronectin i mDA neuron differensieringsmedium supplert med 10 μM Y-27632 (frem til dag 33) og små molekyler og vekstfaktorer (se tabell 2). Kulturceller over natten ved 37 °C og 5 % CO2. På dag 33, erstatte medium av nyberedt DA nevroner differensiering medium supplert med små molekyler og vekstfaktorer (uten Y-27632). Endre medium manuelt hver 3\u20124 dager til dag 65. 6. Immunostaining, automatisert bildeoppkjøp og analyse av høy gjennomstrømming Fluorescens farging Utfør fluorescerende immunstaining som beskrevet i tilleggsfilen 1:trinn 4. Bildeceller som beskrevet i tilleggsfilen 1: trinn 1.2. Last opp bildefiler generert av bildesystemet til bildeanalyseprogramvaren 2 (se Materials tabell) for videre bildeanalyse, som beskrevet i trinn 6.2. Bildeanalyse ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren 2 Når bildefiler er lastet opp i bildeanalyseprogramvare 2, gå til “bildeanalyse” -funksjonen og bygge analysealgoritmen ved hjelp av rullegardinmenyen. Velg kjerner ved hjelp av oppgaven “finn kjerner”, som oppdager regioner på bildet som tilhører cellekjerner (her farget med Hoechst). Ekskluder kjerner fra døde celler (pyknotiske kjerner) ved å sette en terskel for kjernefysisk område eller diameter. Velg cellen cytoplasma ved hjelp av oppgaven “finn cytoplasma”. Denne oppgaven oppdager områder rundt kjerner som tilhører cellecytoplasma. Inkluder bare godt segmenterte celler. Ekskluder mitotiske, apoptotiske og dårlig segmenterte celler. Fjern celler som berører kantlinjen på bildet. Legg til oppgavene “beregn morfologiegenskaper” og “beregn intensitetsegenskaper”. Morfologiparametrene inkluderer beregning av morfologiegenskaper som område for et interesseområde. Intensitetsparametrene inkluderer beregning av intensitetsegenskaper som gjennomsnittlig intensitet for et område av interesse (f.eks. cytoplasma av nevroner). Velg en underpopulasjon (f.eks. TH-positive nevroner) av inngangspopulasjonen (alle cytoplasmer valgt) ved hjelp av én eller flere forhold, morfologi og/eller intensitet.MERK: Vanligvis er intensitet valgt for nevroner. Basert på negative kontroller er det mulig å definere over hvilken intensitetsterskel nevronene anses som positive for TH. Definer utdataresultatene. Dette er den siste byggesteinen i hver analyse. Den definerer analysens avlesningsverdier for hver brønn av en kulturplate (resultater per brønn). Kjør batchanalysen og eksporter resultatene. Normaliser antall positive celler til det totale antallet kjerner og representerer data som prosentandelen av positive celler. 7. Kvantitativ polymerasekjedereaksjon i sanntid (qRT-PCR) Utfør qRT-PCR-protokollen som beskrevet i tilleggsfilen 1:trinn 3.

Representative Results

Vårt automatiserte cellekultur- og bildesystem ble designet for å minimere menneskelig intervensjon slik at vi kan standardisere dyrking av hiPSC og differensiering i forskjellige celletyper som kortikale eller midbrain dopaminergiske (mDA) nevroner. En skjematisk oversikt over vårt automatiserte cellekultursystem med integrerte bildeenheter er avbildet i figur 1. Den første introduksjonen av cellekulturer til dette automatiserte cellekultursystemet kan enten gjøres ved automatisk såing av celler fra et 50 ml rør eller ved å bruke metoden “Loading Of Culture Plates” eller “Loading Of Assay Plates” for import av kultur- eller analyseplater. En sentral del av systemet vårt er væskehåndteringsstasjonen der alle væskeoverføringstrinn som medieendringer eller subkultivasjoner utføres. Den skreddersydde dekkoppsettet til væskebehandlingen er representert i figur 2. Væskehåndteringsstasjonen er utstyrt med fire posisjoner. Opptil fire plater kan overføres fra inkubatoren til decket, slik at parallelle medieendringer. Siden i subcultivation metoden, både foreldre og datter kultur plater må innkvarteres på dekk, maksimalt antall kulturplater behandlet parallelt er begrenset til to. Et viktig trekk ved den flytende håndteringsstasjonen er muligheten til å vippe platene under medieendring for fullstendig fjerning av cellekultur supernatant. Også væskehåndteringsstasjonen er utstyrt med shakers for å favorisere enzymatisk dissosiasjon av celler under utførelsen av subkultivasjonsprotokollen. Vårt automatiserte kultursystem er også utstyrt med to bildesystemer: et brightfield imaging cytometer for å utføre celletelling og samløpet sjekker og derfor overvåke celleveksten over tid, og en dobbel spinnende disk confocal mikroskop for rask, høyt innhold og høyoppløselig avbildning av celler. HiPSC-kulturene overvåkes daglig for vekst ved brightfield imaging cytometer og analyseres for prosentandel av samløpet. Brightfield-bildet i venstre panel og i høyre panel en grønn maske fra analysen av brightfield-bildet oppnådd med cytometeret (figur 3A). En homogen hiPSC-vekst observeres over tid, som vist ved samløpetsprosentene for to hiPSC-linjer (n = 4 plater) dyrket parallelt og utsatt for samløpetskontroller fra dag 1 til dag 6 (figur 3B). Når du når den angitte terskelen, blir hiPSC passasjer. Cellelinjene ble dyrket manuelt (m) eller av automatiseringssystemet (a) og observert for vedlikehold av typisk stamcellemorfologi i minst to passasjer, representative brightfield-bilder (figur 4A). HiPSC-kultivert manuelt (ikke vist) eller i det automatiserte systemet viste den typiske stamcellemarkøren OCT4 (rød) og SSEA4 (grønn), som vist i immunofluorescence-analysen (figur 4B). Uttrykket for pluripotensmarkørene OCT4, NANOG og REX1 ble også vurdert på mRNA-nivå etter qRT-PCR (figur 4C). Relative kvantifiseringer ble utført med prøver samlet inn fra en cellelinje dyrket manuelt (m) og i det automatiserte kultursystemet (a) i duplikater (replikerer 1 og 2). Uttrykksnivåene til alle tre pluripotency markører i repliker som dyrkes i det automatiserte kultursystemet ligner på markøruttrykk etter manuell kultur. På dag 8 (D8) var uttrykket for pluripotensmarkører fraværende i kortikale nevroner differensiert (Diff) fra hiPSC. En viktig anvendelse av det automatiserte kultursystemet er differensieringen av hiPSC i forskjellige celletyper, inkludert nevroner. Her viser vi differensieringen av hiPSC i nevroner ved hjelp av NGN2-strategien, som produserer en ren kortikal nevronkultur på svært kort tid (ca. 6 dager). Nevroner differensiert i det automatiserte kultursystemet (a) presenterte lignende morfologi og nevronal nettverksorganisasjon som nevronene dyrket manuelt (m) (Figur 5A). Automatiserte differensierte kortikale nevroner var positive for TUBB3 (nevronspesifikke klasse III β-tubulin, rød) og BRN2 (øvre kortikale lagmarkør, grønn) (figur 5B), sammenlignbar med manuelt differensierte nevroner (data som ikke vises). Uttrykket av nevronale markører, inkludert mikrotubuliserte protein 2 (MAP2),nevrale celleadhesjonsmolekylet (NCAM1) og Synapsin-1 (SYN1), samt de kortikale nevronmarkørene BRN2 og CUX1 (øvre kortikale lag) ble beriket i nevroner på dag 8 (D8) av differensiering (figur 5C). Svært lavt eller ingen uttrykk for disse markørene ble observert i hiPSC. Relative kvantifiseringer ble utført med prøver samlet inn fra en cellelinje dyrket manuelt (m) og i det automatiserte kultursystemet (a) i duplikater (replikerer 1 og 2). Uttrykksnivåene i replikeringer viser lignende variasjoner mellom manuelt og automatiserte differensieringer. Den integrerte bildebehandlingsevnen til det automatiserte kultursystemet gjør det mulig å bruke håndfri datainnsamling for kulturenes helse, slik at langsiktig automatisert oppkjøp av fenotypiske avlesninger. Ved hjelp av NGN2-tilnærmingen til et lite molekyl avledet nevrale forløperlinje (smNPC) som ble transdusert med GFP lentivirus, etablerte vi en live-celle automatisert neurittvekstanalyse der neurittlengde ble målt over 11 dager med differensiering uten manuell inngrep. Neurite kompleksiteten økte over tid, som demonstrert av området okkupert med neurites på dag 1, 3 og 11, GFP uttrykk og maskerte bilder fra analyse (Figur 6A, B). Økningen i neurittlengde fra dag 1 til 11 av differensieringen ble kvantifisert og viste en lignende utvikling på tvers av ulike brønner. For enkelhets skyld er data fra bare 3 kolonner med 6 brønner hver fra en 96-brønnsplate avbildet i den representative grafen, selv om alle indre 60 brønner ble analysert (figur 6C). En annen anvendelse av det automatiserte kultursystemet som vises her er differensieringen av hiPSC i mDA-nevroner. Differensieringen er basert på medieendringer etter en forhåndsetablert protokoll og ble utført på det automatiserte kultursystemet fra dag 0 til 65. Automatiserte medieendringer forårsaket ikke celleavløsning eller andre visuelt påvisbare endringer i differensieringen. På slutten av differensieringen, på dag 65, mDA nevroner viser cellulær organisasjon og morfologi (sfærisk soma, lange og spiny dendritter) sammenlignes med manuell differensiering (Figur 7A, B). På mRNA-nivå viser mDA-nevroner differensiert i det automatiserte kultursystemet uttrykket for nevronale og mDA-markører, MAP2 og TH (tyrosinhydroksylase), henholdsvis (figur 7C). Begge differensiasjonene genererte betydelige mengder TH og MAP2 positive nevroner (figur 7D). Figur 1: Skjematisk oversikt over den automatiserte cellekulturen og bildeplattformen.Systemet ble designet med et polykarbonathus og to HEPA-hetter (A og B) utstyrt med fire UV-lamper som sikrer et sterilt miljø for cellekulturapplikasjoner. Cellekulturplater lastes på hyller foran robotarmen som kan nås via inngangsdøren (C). Platene er lastet inn i CO2 inkubatoren (D) med en kapasitet på 456 plater. Et brightfield cellecytometer (E) brukes til samløpetskontroller og celletelling under subkultivasjonsrutiner. Væskehåndteringsstasjonen er under en av HEPA-hettene (B). Dekksoppsettet til væskebehandleren er beskrevet i figur 2. Pipetteringsarmen til den flytende håndteringsstasjonen har et 96-kanals pipetteringshode, åtte 1 ml pipetteringskanaler og fire 5 ml pipetteringskanaler. Ved 1 ml pipetteringskanaler kan spisser eller nåler brukes til væskeoverføringer. For screeningformål kan celler som er seeded i analyseplater behandles med prøver lagret ved -20 °C i det automatiserte -20 °C lagringssystemet (F) etter tining av disse prøvene i en annen inkubator (G). Bildebehandling med høy gjennomstrømning utføres i det automatiserte konfokale mikroskopet (H) som tilbyr å skaffe bilder i konfokal modus ved hjelp av to spinnende plater eller i epifluorescence-modus. Et levende cellekammer integrert i mikroskopet gjør det mulig å utføre langsiktig avbildning av kultiverte celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Dekksoppsettet til væskehåndteringsstasjonen.Spissposisjoner indikeres med “50 μL” for 50 μL-spisser, med “standard” for 300 μL-spisser, med “høy” for 1 ml tips og med “5 ml” for 5 ml tips. Deck komponenter: (A) Fire oppvarmede shaker posisjoner (maks hastighet: 2500 rpm) som kan brukes til en hvilken som helst kultur plate eller analyse plate format. Shakerposisjonene er utstyrt med klembare gripere som også brukes til platejustering etter transporter til aggregatet. Videre fungerer shakerposisjonene som en lokkparkeringsposisjon for plater under væskeoverføringstrinn. For representative formål er alle shaker stillinger okkupert av 96 godt analyseplater. (B) Fire vippemoduler for behandling av fire plater av et hvilket som helst format samtidig er plassert på toppen. Den laveste posisjonen markerer avfallsinnsamlingskammeret for kultur- og analyseplater og 96-kanals pipetteringshodet. For representative formål er alle vippemoduler okkupert av 96-brønnanalyseplater. (C) På øverste posisjon er 384-brønnsplaten for celletelling plassert. Nedenfor er to posisjoner for plater som er okkupert av 96-brønnplater for representative formål og et stativ for fire 50 ml og fire 15 ml rør. Den laveste posisjonen er opptatt av 5 ml tips. (D)Tre medielinjer med posisjoner for mediereservoarer. Medielinjene har sensorer på flytende nivå som gjør det mulig å fylle mediereservoaret automatisk med opptil 250 ml medier. (E) To væskeavfallsmoduler med aktivt avløp er basert på toppen, under en temperaturkontrollert modul med en posisjon for en beholder (hvit) og et 5 ml spissstativ er plassert. (F) Fem posisjoner for 1 ml tips. (G)To temperaturkontrollerte moduler er plassert nederst og en posisjon for parkering av ett av lokkene på toppen. (H) Posisjoner for to 50 μL nestede spissstativer (NTR) øverst etterfulgt av to posisjoner for enkanals og 96-kanals plukking på 300 μL-spisser og et 5 ml spissstativ nederst. (I) En stabler for 384-brønntellingsplater øverst etterfulgt av tre 300 μL NTR og et 5 ml spissstativ nederst. Oppbevarings-og vaskestasjon for tre sett med åtte gjenbrukbare metall 1 ml kanyler. (K) Avfallsposisjon for 1 ml og 5 ml pipetteringskanaler og tomme NTR (grå) samt en griperblokk for 1 og 5 ml kanaler (hvit) som brukes til transporttrinn på dekk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Automatisert samløpetskontroll av hiPSC.(A) Representative brightfield (BF) bilder av hiPSC tatt av celle cytometer (venstre) og etter automatisert samløpet analyse (høyre) indikerer proporsjonalt område okkupert av celler i grønt; (B)Samløpet prosenter registrert fra to hiPSC linjer (iPS #1 og #2) fra dag 1 til 6 av kultur, n = 4 1-brønn plater per cellelinje. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Passaging av hiPSC.(A) BF bilde av en hiPSC linje vokst manuelt (venstre) og ved hjelp av det automatiserte kultursystemet (høyre). Bilder ble tatt 6 dager etter den andre passaging; (B)Representative bilder av hiPSC farget for pluripotency markører OCT4 og SSEA4, og motvirket med Hoechst 33342 (Nuclei); (C) Resultater av qRT-PCR for pluripotency markører OCT4, NANOG og REX1 i en hiPSC linje dyrket i duplikater (1 og 2) manuelt (m) og i det automatiserte kultursystemet (a), og de respektive hiPSC-avledede kortikale nevroner (Diff) på dag 8 (D8) av differensiering. Dataene representeres som det relative antallet (RQ) ved hjelp iPS_a_1 som referanseeksempel. Feilfelt representerer standardavvik (SD) fra 3 tekniske replikeringer av qRT-PCR-reaksjon. GAPDH, RPL13A1 og RPLPO ble brukt som rengjøringsgener. Skala bar: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: Menneskelige iPSC-avledede kortikale nevroner.(A)Brightfield bilder av dag 6, manuelt (m) og automatisert (a) differensiert kortikale nevroner som viser lignende nevronale nettverk; (B)Representative bilder av celler farget for TUBB3 (pan neuronal), BRN2 (kortikale nevroner) og Hoechst 33342 (kjerner) på dag 8 av differensiering; (C) Resultater av qRT-PCR for markørgener av kortikale nevroner (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 og SYN1) beriket på dag 8 (D8) av differensiering. Dataene representeres som det relative antallet (RQ) ved hjelp iPS_a_1 som referanseeksempel. Feilfelt representerer SD fra 3 tekniske replikeringer av qRT-PCR-reaksjon. GAPDH, RPL13A1 og RPLPO ble brukt som rengjøringsgener. Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 6: En analyse med høy gjennomstrømning for neurittvekst.(A)Representative bilder av GFP som uttrykker celler på dag 1, 3 og 11 av differensiering; (B) Representative binære bilder av neuritt på dag 1, 3 og 11 av differensiering. Den neuritt utvekst ble kvantifisert ved hjelp av høyinnhold bildeanalyse programvare 1 og er representert som neurite lengde; (B) Grafikken viser økningen i nøyrittlengde i NPC-avledede NGN2-nevroner og dannelse av et tett nettverk. Tre 96-brønnsplater med celler i de indre 60 brønnene er avbildet. For enkelhets skyld vises bare tre kolonner med brønner per 96-brønnsplate som et eksempel med n = 6 brønner per kolonne. I gjennomsnitt 1308 celler ble analysert per brønn. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (S.E.M.). Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 7: Humane iPSC-avledede mDA-nevroner.Midbrain DA nevroner differensiert manuelt (m) og i automatisert (a) kultursystem. (A, B) Representative fluorescerende bilder av mDA nevroner farget for tyrosinhydroksylase (TH, mDA neuron markør; grønn), MAP2 (neuronal markør; rød) og Hoechst 33342 (kjerner; blå); (C) Representative qRT-PCR resultater for markør gener av mDA nevroner differensiert manuelt og i det automatiserte kultursystemet. TH- og MAP2-uttrykksnivåene er representert som relativ mengde (RQ) normalisert til rengjøringsgener (OAZ1 og GAPDH); (D) Prosentandeler av TH og MAP2 positive nevroner generert av manuell og automatisert differensiering. Feilfelt representerer SD for to uavhengige differensieringer utført med to forskjellige iPSC-linjer (#1 og #2). Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Celletype Formål Protokoll trinn Celletetthet Plate format Cellenummer/brønn NGN2 differensiering Ipsc NGN2 stabil linjeproduksjon S.2.3. 30 000 celler/cm2 12-brønn 1,17,000 Ipsc NGN2 neuron differensiering 3.1.3. 30 000 celler/cm2 1-brønn 25,20,000 Ipsc NGN2 neuron differensiering 3.1.3. 30 000 celler/cm2 96-brønn 9,600 smNPC-generasjon 2007: 100 Replating dag 12 og 16 S5.9. og S5.11. 70 000 celler/cm2 6-brønn 6,72,000 2007: 100 Replating fra passasje 5 5.11. 50 000 celler/cm2 6-brønn 4,80,000 2007: 100 smNPC til NGN2 nevroner 3.2.2 50 000 celler/cm2 96-brønn 16,000 mDA differensiering Ipsc mDA neuron differensiering 4.1.2. 200 000 celler/cm2 1-brønn 1,68,00,000 DA nevroner Dag 25 omplating 4.3.2. 400 000 celler/cm2 1-brønn 3,36,00,000 DA nevroner Dag 25 omplating 4.5.2. 100 000 celler/cm2 96-brønn 32,000 Belegg Formål Protokoll trinn Konsentrasjon/Fortynning Plate format Detaljer om belegg iPS-kulturen Ekstracellulær matrise iPSC, NGN2 linje,mDA nevroner 1.5.7. og S2.3. 1 aliquot*;25 ml DMEM/F-12 1-/12-brønn 8/0,5 ml/brønn; 1 t ved RT NGN2 differensiering Poly-L-ornitin NGN2 neuron differensiering 3.1.3. og 3.2.2. 0,1 mg/ml; Pbs 1-/96-brønn 8/0,1 ml/brønn; 12 t ved 37 °C;3x PBS vask Laminin (andre enn 1980 NGN2 neuron differensiering 3.1.3. og 3.2.2. 5 μg/ml; Pbs 1-/96-brønn 8/0,1 ml/brønn; 4 t ved 37 °C smNPC-generasjon Ekstracellulær matrise smNPC generasjon og kultur S5.6., S5.9.,S5.11. 1 aliquot*;25 ml DMEM/F-12 6-brønn 1 ml; 2 t ved RT mDA differensiering Ekstracellulær matrise mDA differensiering 4.1.2. 1 aliquot*;25 ml DMEM/F-12 1-brønn 12 ml; 12 t ved 37 °C Poly-L-ornitin mDA differensiering 4.3.2. og 4.5.2. 0,1 mg/ml; Pbs 1-/96-brønn 12/0,1 ml/brønn;12 t ved 37 °C; 3x PBS vask Laminin (andre enn 1980 mDA differensiering 4.3.2. og 4.5.2. 10 μg/ml; Pbs 1-/96-brønn 12/0,1 ml/brønn; 12 t ved 37 °C Fibronectin mDA differensiering 4.3.2. og 4.5.2. 2 μg/ml; Pbs 1-/96-brønn 12/0,1 ml/brønn; 12 t ved 37 °C *En ekstracellulær matrise aliquot er definert som fortynningsfaktoren (i μL) som finnes i analysesertifikatet for dette produktet. Tabell 1: Seeding celle tetthet og belegg henholdsvis til plateformatet. Dag Reagent Dag 0 – 1 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542 Dag 1 – 3 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM purmorfamin,100ng/ml FGF-8b Dag 3 – 5 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM purmorfamin,100ng/ml FGF-8b, 3 μM CHIR99021 Dag 5 – 7 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorfamin, 100ng/mLFGF-8b,3 μM CHIR99021 Dag 7 – 9 100 nM LDN193189, 1 mM TT, 3 μM CHIR99021 Dag 9 – 11 100 nM LDN193189, 1 mM TT, 3 μM CHIR99021 Dag 11 – 13 3 μM CHIR99021, 20 ng/ml BDNF, 0,2 mM L-askorbinsyre (AA1), 20 ng/mlGDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT Dag 13 – 65 20 ng/ml BDNF, 0,2 mM L-askorbinsyre (AA1), 20 ng/ml GDNF, 1 mM db-cAMP,1 ng/ml TGFß3, 10 μM DAPT Tabell 2: Lite molekyltillegg for dopaminerge neurondilatering. Dag KSR medium N2 medium Differensieringsmedium Dag 0 – 1 100% 0 0 Dag 1 – 3 100% 0 0 Dag 3 – 5 100% 0 0 Dag 5 – 7 75% 25% 0 Dag 7 – 9 50% 50% 0 Dag 9 – 11 25% 75% 0 Dag 11 – 13 0 0 100% Dag 13 – 65 0 0 100% Tabell 3: Mediegradient for dopaminerge nevrondilatering. Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Vi introduserer et automatisert cellekultursystem med integrerte bildefunksjoner for standardisering av hiPSC-kultur og nevronal differensiering. På grunn av minimal brukerintervensjon er eksperimentell variasjon lav som sikrer reproduserbarhet av cellulære fenotyper under differensiering. Den kalenderbaserte planleggeren støtter organiseringen og parallelliseringen av eksperimenter og gir høy grad av fleksibilitet når eksperimentene utføres. Eksisterende metoder kan enkelt tilpasses og spekteret av tilgjengelige metoder kan økes. I tillegg kan et stort antall analyseplateformater brukes til å legge til fleksibiliteten til dette systemet. Det minimale systemet som består av en CO₂ inkubator, en robotarm, et brightfield cellecytometer og en flytende håndteringsstasjon danner den grunnleggende enheten som trengs for hiPSC-kultur og differensiering, med rimelige kostnader til akademiske forskningslaboratorier. Kombinasjonen av det automatiserte cellekultursystemet med et automatisert -20 °C lagringssystem for lagring av forbindelser, RNAi-biblioteker eller CRISPR/Cas9-biblioteker, og integrering av et mikroskop med høy innhold/høy gjennomstrømning gjør det mulig å utføre fenotypiske screeninger.

I den nåværende studien brukte det automatiserte cellekultursystemet engangstips, og kulturmediene ble fylt på manuelt inn i reservoaret, og dermed begrenset bruken av væskehåndteringsstasjonen for medieendringer og andre kulturprosesser spesielt over natten. For å omgå denne begrensningen kan metodene justeres til nålebruk i stedet for engangsspisser, og etter å ha installert rørforbindelser mellom medielinjer og medieposer lagret i kjøleskap, kan mediereservoarer automatisk fylles med friske medier forhåndsvarmet av varmeelement. Dette vil redusere brukerforstyrrelser forårsaket av manuell påfylling av tips, kulturmedier og reservoarutveksling.

Vårt automatiserte cellekultursystem gir flere fordeler. Den ene er strekkodesporingssystemet. Platene som lastes i systemet identifiseres av en unik strekkode som leses og lagres av systemet som tillater sporing av prøver under og etter metodekjøring. En annen fordel er muligheten til å opprette brukerspesifikke prosjekter. Her kan kulturplater lastet i systemet tilordnes til et bestemt prosjekt og grupperes i grupper. Struktureringen i grupper forenkler utførelsen av samme prosedyre til alle plater av en bestemt batch siden ingen individuelle plater må velges. I tillegg gjør en redigeringsprogram for flytende klasse det mulig å justere pipetteringshastigheten og høyden, samt aspirasjons- og dispenseringsparametrene for hvert væskeoverføringstrinn. Hver prosess er dokumentert i loggfiler som tillater å spore hvilke oppgaver som er utført for en gitt kultur eller analyseplate.

Nevroner og andre celletyper avledet fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC) er nyttige in vitro-verktøy for å studere mekanismene for nevrodegenerative sykdommer i bestemte pasientpopulasjoner (f.eks. dopaminerge nevroner for Parkinsons sykdom) som gir mulighet for personlig legemiddelscreening. Culturing hiPSC er svært tidkrevende og krever trente mennesker til å utføre komplekse differensieringsprotokoller, vanligvis begrenset til lavskala produksjon. Vi tilpasset den materfrie kulturen i hiPSC til en automatisert kultur og implementerte to nevronale differensieringsprotokoller, en rask kortikal neuron differensieringsprotokoll basert på NGN2-overuttrykk under en tet-on promotor^10,11og en langsiktig liten molekylbasert protokoll for generering av midbrain dopaminerge (mDA) nevroner¹³. Den enkle overføringen og reproduserbarheten til manuell kultur og differensieringsprotokoller gjør det automatiserte kultursystemet svært nyttig. Menneskelig iPSC dyrket i det automatiserte cellekultursystemet viste konsekvent stamcellemorfologi og uttrykte viktige pluripotensmarkører, reproduserbare mellom uavhengige eksperimenter. I tillegg favoriserte automatiseringen av hiPSC-kulturprotokollen kulturen og utvidelsen av et større antall cellelinjer parallelt. Automatiserte samløpet kontroller planlagt å bli utført over natten spart tid forlater systemet gratis i løpet av dagen for nedstrøms prosesstrinn utført når brukeren var i laboratoriet (f.eks høsting av celler eller manuell replating for differensiering). Når de når den brukerdefinerte samløpetsterskelen, blir cellene passasjer og omset til ekstracellulære matrisebelagte plater som er tilgjengelige på stableren til det automatiserte cellekultursystemet. Hver passasje runde tar ca 70 min og genererer fire 1-brønns plater fra en overordnet plate, noe som oversettes til en kapasitet på 20 passasjer på en dag.

Automatiseringen av NGN2 differensieringsprotokollen ble gjort med hell og tillot generering av en homogen populasjon av nevronale celler på tvers av forskjellige passasjer og sammenlignbar med manuelle differensieringer. Videre vil de eksperimentelle kostnadene for store screeningstudier som involverer flere cellelinjer eller screeningeksperimenter med tusenvis av testforhold / forbindelser bli redusert på grunn av raske differensieringer. Kostnadseffektive og høy gjennomstrømmingavlesninger, inkludert live-celle neurite utvekst målinger kan enkelt utvikles, implementeres og brukes som fenotypisk avlesninger for sykdom modellering, som vist tidligere^14,15,16. Dermed tilpasset vi videre NGN2-protokollen ved hjelp av små molekylavledede nevrale forløperceller (smNPC) celler som utgjør over-express GFP. SmNPC-cellene gir ytterligere fordeler, inkludert reduserte kostnader med kulturmedier (en tredjedel av kostnaden med iPSC-kultur) og tid som kreves for å skalere opp eksperimenter. Celleavlingene fra smNPC er 7 til 10 ganger høyere enn det som oppnås med iPSC. Differensieringsnevronene ble vellykket overvåket og avbildet i flere dager ved hjelp av en helautomatisk bildebehandlingsprosess uten behov for manuelle antistoffflekker eller kjemisk merking, noe som sparer kostnader og tid som kreves for manuelle prosedyrer, inkludert avbildningen av seg selv. Den nåværende bildebehandling av indre 60 brønner av en 96-brønns plate tar rundt 16 min per plate når 25 felt per brønn er avbildet, noe som betyr at dataene for en bildebasert screening for 1000 forbindelser, kan anskaffes og analyseres på en dag. I fremtiden kan denne avlesningen brukes i sammensatte screeningstudier for redning av neuritt utvekstdefekter.

Videre demonstrerer vi også overføringen av en manuell differensieringsprotokoll for generering av midbrain dopaminerge (mDA) nevroner fra iPSC. Denne lille molekylbaserte differensieringsprotokollen tar 65 dager og er arbeidsintensiv på grunn av flere replating trinn og hyppige medieendringer, for det meste hver 2 dager, noe som begrenser produksjonen av mDA nevroner til få iPSC-linjer samtidig. Den automatiserte mDA differensieringsprotokollen har den store fordelen av å skalere opp differensieringen til dusinvis av iPSC-linjer. Opptil 30 cellelinjer kan differensieres parallelt. Siden differensieringen for det meste er basert på medieendringer, kan nesten hele differensieringsprosessen utføres uten menneskelig innblanding. Ved hjelp av den kalenderbaserte planleggeren for det automatiserte systemet, kan vi planlegge medieendringene i henhold til differensieringstrinnene. En begrensning av å jobbe med et så stort antall cellelinjer og kulturplater var umuligheten til å utføre over nattens medieendringer. Hovedårsaken er at systemet vårt er satt opp for bruk av engangstips og manuell påfylling av kulturmedier som krever at en bruker i laboratoriet utfører dette manuelle trinnet. For å forenkle medieendringsprosessen ble plater lastet inn i systemet tilordnet til et prosjekt og gruppert i grupper. Batchstørrelsen ble deretter tilpasset antall engangstips og volum av kulturmedier tilgjengelig. Som beskrevet ovenfor, kan denne begrensningen lett overvinnes ved implementering av gjenbrukbare / vaskbare nåler og automatisert påfylling av medier. Automatisert passaging / replating av celler, som vist for iPSC, er en av bekvemmelighetene som tilbys av vårt automatiserte cellekultursystem. Vi har testet den automatiserte replating av mDA nevroner på dag 25 av differensiering. Dissosiasjonen av mDA-nevroner krever imidlertid lengre (40 min) inkubasjon med dissosiasjonsenzymet enn iPSC (8 min) som utvider den automatiserte replatingsprosessen til mer enn 1 time per cellelinjer. Som en konsekvens ble den automatiserte omplatingen av 30 cellelinjer på samme dag umulig. Påstålelse av andre trinn under automatisert omplating (transport av plater, pipettering) og tilpasning av systemet til bruk av nåler og medielinje som gjør et overnattingsarbeid mulig, ville løse denne begrensningen. Til tross for ulempene, kunne vi med hell overføre den manuelle protokollen til en automatisert differensiering av mDA-nevroner som produserer kulturer med betydelige mengder MAP2 (neuron) og TH (mDA nevroner) positive celler.

Differensiering dusinvis av iPSC cellelinjer parallelt er av stor interesse for prosjekter som undersøker molekylære mekanismer av nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom. Men å fullføre oppgaver raskere med færre feil og til reduserte kostnader er en stor utfordring. På grunn av automatisering av protokollene som presenteres her (iPSC, smNPC og mDA neuron), kunne vi fremskynde, redusere kostnadene og øke reproduserbarheten i våre prosjekter. Utviklingen av prosjekter som FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) som involverer hundrevis av pasientcellelinjer viser behov for automatisert kultur og differensieringsprotokoller. Våre fremtidige perspektiver inkluderer overføring av manuelle 3-dimensjonale (3D) cellekulturmodeller til det automatiserte systemet. Mindre tilpasninger i platedefinisjonsinnstillingene og bruk av adaptere vil tillate bruk av kommersielle eller skreddersydde plater og mikrofluidiske kamre som kreves for 3D-kulturene. Videre vil implementeringen av en automatisert etikettfri bildemodell tillate oss å spore den nevronale veksten i sanntid og oversette endringer i neurittvekst, nevronorganisasjon og celledød til bedre forståelse av sykdomsmekanismene.

Materials

Antibodies	Distributor	Catalog Number	Dilution
iPSC pluripotency marker
Mouse anti-SSEA4	Abcam	ab16287	1 to 33
Rabbit anti-Oct3/4	Abcam	ab19857	1 to 200
NGN2 neuron markers
Mouse anti- TUBB3	R & D	MAB1195	1 to 500
Rabbit anti-BRN2	NEB	12137	1 to 1,000
mDA neuron markers
Chicken anti-TH	Pel-Freez Biologicals	12137	1 to 750
Mouse anti-MAP2	Santa Cruz	sc-74421	1 to 750
Secondary antibodies
Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11039	1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029	1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032	1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012	1 to 2,000
Nuclei counterstaining
Hoechest 33342	Invitrogen	H3570	1 to 8,000
Instruments	Distributor	Catalog Number	Description/Application
Agilent TapeStation system	Agilent technologies	4200	Automated electrophoresis for DNA and RNA samples
Automated -20 °C storage system	Hamilton Storage Technologies	Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series)	Storage of reagents
Barcode reader	Honeywell	Barcode Reader Orbit	Barcode scanner
Brightfield cell cytomat	Nexcelom	Celigo	Confluence check and cell counting
CellVoyager 7000	Yokogawa	CellVoyager 7000	Automated confocal microscope
Cytomat for cell cultures	Thermo Fisher Scientific	Cytomat 24 C, CU	12 stackers pitch 28 mm, 12 stackers pitch 23 mm (total of 456 plates)
Cytomat for thawing samples	Thermo Fisher Scientific	Cytomat 2-LIN, 60 DU (Drying Unit)	2 stackers pitch 28 mm (total of 42 plates)
HEPA filters	Hamilton Robotics	Hood Flow Star UV	Modified by Hamilton Robotics
Liquid handling station	Hamilton Robotics	Microlab Star	Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml and 96 Channel MPH
Media reservoir	Hamilton Robotics	188211APE	Media/reagents reservoir
Pure water system	Veolia Water	ELGA PURELAB Classic	Provides pure water for needle wash station
QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	QSTUDIO12KOA	Real-time PCR machine
Robotic arm	Hamilton Robotics	Rackrunner	Transport of plates
Turn table	Hamilton Robotics	Turn Table	Adjust plate orientiation
Uninterruptible power supply	APC	Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power supply	Backup power supply
VIAFLO-pipettes	Integra	4500	Electronic pipette
ViiA 7 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4453545	Real-time PCR machine
Materials	Distributor	Catalog Number	Notes
1-well culture plate (84 cm2)	Thermo Fischer Scientific	165218	Nunc OmniTray
6-well culture plates (9.6 cm2)	Greiner Bio-One	657160	TC treated with lid
12-well culture plate (3.9 cm2)	Greiner Bio-One	665180	TC treated with lid
96-well culture plate (0.32 cm2)	Perkin Elmer	6005558	CellCarrier-96 Black plate
Tips, 50-µL	Hamilton Robotics	235987	50-uL tips
Tips, 300-µL	Hamilton Robotics	235985	300-µL tips
Tips, 1000-µL	Hamilton Robotics	235939	1000-µL tips
Tips, 5-mL	Hamilton Robotics	184022	5-mL tips
Tubes, 15-mL	Greiner Bio-One	188271	15-mL tubes
Tubes, 50-mL	Greiner Bio-One	227261	50-mL tubes
Nalgene cryogenic 2.0 mL vials	Sigma Aldrich	V5007	Cryovials
Plasmids	Distributor	Catalog Number	Notes
pLV_hEF1a_rtTA3	Addgene	61472	Kind gift from Ron Weiss
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro	Addgene	61474	Kind gift from Ron Weiss
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus	Takara Bio	631983
Primers	Sequence (forward)	Sequence (reverse)	Source
iPSC pluripotency
OCT4 (ID 4505967a1)	CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG	GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC	PrimerBank
NANOG (ID 153945815c3)	CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA	CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC	PrimerBank
REX1 (ID 89179322c1)	AGAAACGGGCAAAGACAAGAC	GCTGACAGGTTCTATTTCCGC	PrimerBank
NGN2 neurons
MAP2 (ID 87578393c1)	CTCAGCACCGCTAACAGAGG	CATTGGCGCTTCGGACAAG	PrimerBank
BRN2 (ID 380254475c1)	CGGCGGATCAAACTGGGATTT	TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT	PrimerBank
CUX2 (ID 291045458c2)	CGAGACCTCCACACTTCGTG	TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG	PrimerBank
NCAM1 (ID 336285437c3)	TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC	CTCACAGCGATAAGTGCCCTC	PrimerBank
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)	TGCTCAGCAGTACAACGTACC	GACACTTGCGATGTCCTGGAA	PrimerBank
mDA neurons
TH	CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA	CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA	NCBI primer-BLAST
MAP2	GGATCAACGGAGAGCTGAC	TCAGGACTGCTACAGCCTCA	NCBI primer-BLAST
Housekeeping genes
GAPDH	GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG	GAGCCCCAGCCTTCTCCATG	NCBI primer-BLAST
OAZ1	AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT	ATGAAGACATGGTCGGCTCG	NCBI primer-BLAST
RPLPO	CCTCATATCCGGGGGAATGTG	GCAGCAGCTGGCACCTTATTG	NCBI primer-BLAST
RPL13A	GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC	TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC	NCBI primer-BLAST
Media and Reagents	Distributor	Catalog Number	Use concentration
Coating matrix
Extracellular matrix (Matrigel)	Corning	354277	10 μg/mL
Fibronectin	Corning	356008	2 μg/mL
Laminin	Sigma	L2020	5 – 10 μg/mL
Poly-L-Ornithine (PLO)	Sigma	P3655	0.1 mg/mL
Culture media
iPSC culture medium (Essential 8 Flex medium)	Gibco	A2858501
NGN2 neurons – NGN2 medium
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	0.909 mL (50 µM)
B27 supplement	Gibco	12587010	10 mL (1%)
DMEM/F-12, GlutaMAX	Gibco	31331093	484.75 mL
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL ( 2 mM)
Insulin	Sigma	I9278	0.25 mL (2.5 µg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140050	5 mL (0.5%)
N2 supplement	Gibco	17502048	5 mL (0.5%)
Neurobasal medium	Gibco	21103049	485 mL
mDA neurons – SRM medium
2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	0.5 mL (55 µM)
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL (2 mM)
Knockout DMEM/F-12	Gibco	12660012	409.5 mL
Knockout serum replacement (serum replacement)	Gibco	10828028	75 mL (15%)
MEM Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140050	5 mL (1%)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	5 mL (1%)
mDA neurons – N2 medium
B27 supplement	Gibco	12587010	10 mL (2%)
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL (2 mM)
N2 supplement	Gibco	17502048	5 mL (1%)
Neurobasal medium	Gibco	21103049	475 mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	5 mL(1%)
mDA neurons – Differentiation medium
B27 supplement	Gibco	12587010	10 mL (2%)
Neurobasal medium	Gibco	21103049	485 mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	5 mL (1%)
NGN2 neurons – Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Peprotech	450-02	10 ng/mL
CHIR99021 (CHIR)	R&D	4423/10	2 μM
Doxycyline (dox)	Sigma	D9891	2.5 μg/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF)	Peprotech	450-10	10 ng/mL
L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (AA2)	Sigma	A8960	64 mg/L
Neurotrophic factor-3 (NT-3)	Peprotech	450-10	10 ng/mL
Purmorphamine (PMA)	Cayman	10009634	0.5 μM
Puromycin	Sigma	P8833-10MG	0.5 μg/mL
Thiazovivin	Merk Millipore	420220-10MG	2 μM
mDA neurons – Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Peprotech	450-02	20 ng/mL
CHIR99021 (CHIR)	R&D	4423/10	3 μM
DAPT	Cayman	13197	10 µM
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	1 mM
Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b)	Peprotech	100-25	100 ng/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor (GDNF)	Peprotech	450-10	20 ng/mL
L-ascorbic acid (AA1)	Sigma	A4403	0.2 mM
LDN193189 (LDN)	Cayman	11802	100 nM
Purmorphamine (Purm)	Cayman	10009634	2 μM
Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH)	R&D	1845-SH	100 ng/mL
SB431542 (SB)	Cayman	13031	10 μM
Transforming Growth Factor type ß3 (TGFß3)	R&D	243-B3	1 ng/mL
Y-27632	Cayman	10005583	10 µM
Dissociation reagents
Single cell dissociation reagent (StemPro Accutase)	Gibco	A1110501	1x
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Gibco	11575020	0.5 mM
RNA isolation and cDNA kit
RNA isolation kit	Qiagen	74106	Rneasy MiniKit
RNA lysis buffer	Thermo Fisher Scientific	15596018	Trizol lysis buffer (RNA lysis buffer)
Reverse transcriptase (kit)	Thermo Fisher Scientific	18080-085	SuperScript III Reverse Transcriptase
Software	Company	Catalog Number	Description/Application
Cell Culture Framework (CCF) (Graphical user interface, GUI)	Hamilton Robotics	Custom-made	User interface for the automated system
CellPathFinder software (image analysis software 1)	Yokogawa	CellPathfinder HCS Software	Image analysis tool
CellVoyager Measurement System	Yokogawa	Included with CellVoyager 7000	Microscope controlling software
Columbus software (image analysis software 2)	Perkin Elmer	Columbus	Image analysis tool
Cloud based qPCR app	Thermo Fisher Scientific	Themo Fisher cloud	Analysis software for qRT-PCR data
Venus software	Hamilton Robotics	VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software	Controlling software for the automated system