En kostnadseffektiv og tilpasningsdyktig scratch migrasjon analyse

Summary

Vi presenterer en kostnadseffektiv metode for ripemigrasjonsanalysen som gir en ny tilnærming for å bestemme cellemigrasjon uten bruk av utstyrsintensive metoder. Mens fibroblaster ble brukt i denne protokollen, kan den tilpasses og brukes til å studere flere celletyper og påvirkninger på cellemigrasjon.

Abstract

Cellemigrasjon er en viktig komponent i både fysiologiske og patologiske hendelser. Normal cellemigrasjon er nødvendig for viktige funksjoner som utvikling og montering av immunrespons. Når en defekt eller endring oppstår med cellemigrasjonsprosessen, kan det ha skadelige resultater (det vil si kreftmetastase, sårheling og arrdannelse). På grunn av viktigheten av cellemigrasjon, er det nødvendig å ha tilgang til en cellemigrasjonsanalyse som er rimelig, tilpasningsdyktig og repeterbar. Ved hjelp av den vanlige ripemigrasjonsanalysen har vi utviklet en ny tilnærming til å analysere cellemigrasjon som bruker generelt laboratorieutstyr. Metoden som er beskrevet, bruker visuelle markører som gjør det mulig å gjenerobre bestemte interesseområder uten bruk av time-lapse mikroskopi. I tillegg gir det fleksibilitet i eksperimentell design, alt fra å endre migrasjonsmatrisesubstratet til tilsetning av farmakologiske modifikatorer. Videre skisserer denne protokollen en måte å ta hensyn til celleoverføringsområdet, som ikke vurderes av flere metoder ved undersøkelse av cellemigrasjon. Denne nye tilnærmingen gir en ripemigrasjonsanalyse til et større publikum og vil gi forskerne større mulighet til å undersøke den fysiologiske og patofysiologiske virkningen av cellemigrasjon.

Introduction

Cellemigrasjon er avgjørende for mange fysiologiske så vel som patologiske hendelser. Det er nødvendig under utvikling, for å montere en immunrespons, og for riktig sårheling^1,2,3. Mange av disse cellemigrasjonshendelsene kan utløses av fysiske eller kjemiske signaler. For eksempel, under en immunrespons, vil leukocytter migrere mot et skadested som svar på et kjemoattractant². I tillegg vil leukocytter også frigjøre cytokiner for å indusere migrering av flere immunceller, samt andre celletyper, for eksempel fibroblaster, som er involvert i sårhelingsprosessen, og dermed initiere en flercellet respons⁴. Cellenes evne til å migrere er avgjørende for riktig fysiologisk funksjon; Men når cellemigrasjon går ukontrollert, kan det ha en negativ respons og bidra til patologiske hendelser, for eksempel kronisk betennelse, vaskulær sykdom, kreftmetastase og nedsatt sårheling^2,3,4,5,6,7. Nedsatt sårheling er en vanlig lidelse av diabetikere på grunn av defekter i cellemigrasjon, og hvis disse feilene ikke er adressert, kan det føre til ytterligere komplikasjoner (f.eks.^{amputasjon 8,9}). Denne studien, så vel som andre, har indikert behovet for å ytterligere forstå prosessen der cellemigrasjon oppstår, enten under normale fysiologiske eller patologiske forhold, og det er viktig for å fremme dette forskningsfeltet. For å oppnå dette må det være migrasjonsanalyser tilgjengelig som er både tilgjengelige og rimelige for de forskerne, som kanskje ikke har utstyret som trengs for å gjennomføre disse analysene.

For øyeblikket finnes det en rekke overføringsanalyser tilgjengelig for å undersøke et bredt spekter av emner angående cellemigrasjon. Både 2D- og 3D-migreringsmodeller er utviklet, hver rettet mot bestemte områder som påvirker cellemigrasjon. 3D migrasjon modeller er vanligvis forbundet med celle invasjon studier og vurdere virkningen av ekstracellulær matrise på celle migrasjon^10,11,12,mens 2D migrasjon analyser har et større spekter av søknad og er primært brukt til å studere chemotactic migrasjon, sårheling, og funksjonelle endringer under cellemigrasjon^13,14,15,16. Flere av disse analysene krever ekstra utstyr, for eksempel Boyden kamre eller eksklusjonsringer, noe som kan redusere tilgjengeligheten av disse analysene til visse forskere. En av de mer kostnadseffektive analysene er ripeanalysen, som vanligvis brukes til å vurdere sårheling og generelle endringer i cellemigrasjon^14,17. Mens de fleste laboratorier er utstyrt for å gjennomføre en ripeanalyse, har utstyret som brukes til å spore cellemigrasjon, en tendens til å enten være utilgjengelig eller for dyrt å kjøpe. Dette inkluderer time-lapse mikroskopi, som krever et omvendt mikroskop og et levende bildesystem. Disse dyre delene av utstyret er ikke allment tilgjengelig for hvert laboratorium. Derfor understreker denne observasjonen behovet for en ny protokoll som gjør det mulig å vurdering av cellemigrasjon med lettere tilgjengelig utstyr.

Protokollen som presenteres her gir en ny og rimelig måte å vurdere cellemigrasjon på. Denne metoden følger samme prosedyre forbundet med ripeanalyser, men varierer i analysen av å undersøke cellemigrasjon ved å bruke utstyr som er mer tilgjengelig i en grunnleggende vitenskapslaboratoriuminnstilling. Denne protokollen ved hjelp av felles utstyr gir en mer nøyaktig bestemmelse av cellemigrasjon uten bruk av time-lapse mikroskopi. I tillegg til å bestemme overføring, står denne metoden også for variable faktorer i kladdeområdet som har blitt notert for å ha stor innvirkning på celleoverføring. Samlet sett gir denne nye protokollen for celleoverføringsanalyse en mulighet for flere laboratorier til å utforske og bidra til cellemigrasjonsområdet.

Protocol

1. Generell cellekultur Kultur hjertefibroblaster i Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) som inneholder 1 g / L glukose, natriumpyuvat, L-glutamin og supplert med 14,2 mM NaHCO3,14,9 mM HEPES, 15 % varmeinaktivert fostervinserum (FBS), 2 % L-glutamin og 0,02 % antimikrobiell reagens (se Materialtabell)og vedlikeholdes i CO2 inkubator ved 37 °C. Kultur hjertefibroblaster til 90-95% samløpet nås ved passasje 0 (P0). På dette punktet fibroblastene er klare t…

Representative Results

Denne prosedyren dokumenterer en ny tilnærming til å studere cellemigrasjon som er både kostnadseffektiv og lett tilpasningsdyktig for de fleste laboratorier. Mange studier har brukt time-lapse mikroskopi for å vurdere cellemigrasjon, men utstyret som kreves for denne metoden er ikke lett tilgjengelig for mange laboratorier. Mens bruk av linjer og bindestreker for avgrensning gir mulighet til å gjenerobre bestemte interesseområder på forskjellige tidspunkter uten bruk av dyrt utstyr (figur 1</…

Discussion

Denne nye tilnærmingen til scratch migrasjon analyse gir en mer tilgjengelig metode for forskere å undersøke endringer i cellemigrasjon. Selv om denne analysen følger samme prosedyre for å administrere en ripe som ligner på andre ripeanalyser, gir den en ny metode for avbildning og nøyaktig analyse av cellemigrasjon¹⁰. I stedet for å bruke utstyrsintensive metoder for tidsforløp mikroskopi og levende celle bildekamre, denne metoden detaljer bruk av allment tilgjengelig lab utstyr. Ved hje…

Materials

Adobe All Apps	Adobe		This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile	MIDSCI	AVR1	Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera	Zeiss	426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250	Fisher Scientific	BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells	Fisher Scientific	07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate	Fisher Scientific	MT10014CM
Image J	NIH		This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum	Innovative Research	IFBS-HU
Primocin	InvivoGEN	ant-pm-2	This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope	Zeiss	491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software	Zeiss		software comes with camera purchase