Maliyet Etkin ve Uyarlanabilir Çizilme Göçü Tsası
Summary
Ekipman yoğun yöntemler kullanılmadan hücre göçünün belirlenmesinde yeni bir yaklaşım sağlayan sıfırdan geçiş testini uygun maliyetli bir yöntem savuruyoruz. Bu protokolde fibroblastlar kullanılırken, ek hücre tipleri ve hücre göçü üzerindeki etkileri incelemek için uyarlanabilir ve kullanılabilir.
Abstract
Hücre göçü hem fizyolojik hem de patolojik olayların önemli bir bileşenidir. Normal hücre göçü geliştirme ve bir bağışıklık yanıtı montaj gibi temel fonksiyonlar için gereklidir. Hücre göç süreci ile bir defekt veya değişiklik meydana geldiğinde, zararlı sonuçlar (yani, kanser metastazı, yara iyileşmesi ve skar oluşumu) olabilir. Hücre geçişinin önemi nedeniyle, uygun fiyatlı, uyarlanabilir ve tekrarlanabilir bir hücre geçiş tadına erişim olması gerekir. Ortak sıfırdan geçiş testini kullanarak, genel laboratuvar ekipmanı kullanan hücre göçlerini analiz etmek için yeni bir yaklaşım geliştirdik. Açıklanan yöntem, hızlandırılmış mikroskopi kullanılmadan belirli ilgi alanlarının yeniden yakalanmasına olanak tanıyan görsel belirteçler kullanır. Buna ek olarak, deneysel tasarımda esneklik sağlar, göç matris substrat ı değiştirmekten farmakolojik değiştiriciler eklenmesine kadar. Ayrıca, bu protokol hücre geçişi incelenirken çeşitli yöntemlertarafından dikkate alınmayan hücre geçişi alanını hesaba katmanın bir yolunu özetler. Bu yeni yaklaşım daha büyük bir kitleye bir sıfırdan göç tetkik sunuyor ve araştırmacılar için hücre göç fizyolojik ve patofizyolojik etkisini incelemek için daha büyük bir fırsat sağlayacaktır.
Introduction
Hücre göçü birçok fizyolojik ve patolojik olaylar için çok önemlidir. Bu gelişme sırasında gereklidir, bir bağışıklık yanıtı montaj için, ve uygun yara iyileşmesi için1,2,3. Bu hücre geçiş olaylarının çoğu fiziksel veya kimyasal sinyaller tarafından tetiklenebilir. Örneğin, bir bağışıklık yanıtı sırasında, lökositler bir kemoattractant yanıt olarak yaralanma bir siteye doğru göç edecek2. Ayrıca, lökositler de ek bağışıklık hücrelerinin göç indüklemek için sitokinler serbest bırakacaktır, yanı sıra diğer hücre tipleri, fibroblastlar gibi, yara iyileşme sürecinde yer alan, ve böylece, çok hücreli bir yanıt başlatılması4. Hücrelerin göç yeteneği uygun fizyolojik fonksiyon için gereklidir; ancak, hücre göçü kontrolsüz gittiğinde, bu olumsuz bir yanıt olabilir ve patolojik olaylara katkıda bulunmak, kronik inflamasyon gibi, vasküler hastalık, kanser metastazı, ve bozulmuş yara iyileşmesi2,3,4,5,6,7. Bozulmuş yara iyileşmesi hücre göçündeki bozukluklar nedeniyle şeker hastalarının sık görülen bir hastalığıdır ve bu bozukluklar ele alınmazsa daha fazla komplikasyona yol açabilir (örn. ampütasyon8,9). Bu çalışma, diğerleri gibi, hücre göçünün normal fizyolojik veya patolojik koşullar altında meydana geldiği süreci daha iyi anlama gereğini ortaya konmuş ve bu araştırma alanını ilerletmek için hayati önem taşımaktadır. Bunu başarmak için, bu tahlilleri yapmak için gerekli ekipmana sahip olmayan araştırmacılar için hem erişilebilir hem de uygun fiyatlı göç tahlilleri olması gerekir.
Şu anda, hücre geçişi ile ilgili konuların geniş bir yelpazede incelemek için kullanılabilir geçiş tahlilleri çeşitli vardır. Her biri hücre göçlerini etkileyen belirli alanları hedefleyen 2B ve 3B geçiş modelleri geliştirilmiştir. 3D göç modelleri genellikle hücre istilası çalışmaları ile ilişkilidir ve hücre göçü üzerinde hücre dışı matriks etkisini değerlendirmek10,11,12, 2D göç tahlilleri uygulama daha geniş bir aralığı var ve öncelikle kemotaktik göç çalışma için kullanılır, yara iyileşmesi, ve hücre göçü sırasında fonksiyonel değişiklikler13,14,15,16. Bu tahlillerin bazıları, Boyden odaları veya dışlama halkaları gibi bazı araştırmacılara bu tahlillerin kullanılabilirliğini azaltabilecek ek ekipman gerektirir. Daha uygun maliyetli tahlillerden biri, genellikle yara iyileşmesini ve hücre göçündeki genel değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan çizik tahlilleridir14,17. Çoğu laboratuvar bir çizik teşp yapmak için donanımlı olsa da, hücre göç izlemek için kullanılan ekipman ya kullanılamaz ya da satın almak için çok pahalı olma eğilimindedir. Bu, ters mikroskop ve canlı görüntüleme sistemi gerektiren hızlandırılmış mikroskobu içerir. Bu pahalı ekipman parçaları her laboratuvar için yaygın olarak erişilebilir değildir. Bu nedenle, bu gözlem daha hazır ekipman ile hücre göçünün değerlendirilmesi sağlayan yeni bir protokol ihtiyacını vurgulamaktadır.
Burada sunulan protokol hücre göçünü değerlendirmek için yeni ve uygun fiyatlı bir yol sağlar. Bu yöntem, çizik tahlilleri ile ilişkili aynı prosedürü izler, ancak temel bilimler laboratuvar ortamında daha yaygın olarak bulunan ekipmanları kullanarak hücre göçünün incelenmesinde farklılık gösterir. Ortak ekipman kullanan bu protokol, hızlandırılmış mikroskopi kullanılmadan hücre geçişinin daha doğru belirlenmesini sağlar. Bu yöntem, geçişi belirlemenin yanı sıra, hücre geçişini büyük ölçüde etkilediği belirtilen çizilme alanındaki değişken faktörleri de hesaba kattırır. Genel olarak, hücre göçü analizi için bu yeni protokol, daha fazla laboratuvarın hücre göçü alanını keşfetmesi ve katkıda bulunması için bir fırsat sağlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sıfırdan geçiş tadına yönelik bu yeni yaklaşım, araştırmacıların hücre geçişindeki değişiklikleri incelemeleri için daha erişilebilir bir yöntem sağlar. Bu tahlil diğer çizik tahlilleri benzer bir çizik yönetmek için aynı prosedürü takip ederken, görüntüleme ve hücre göçü10doğru analizi için yeni bir yöntem sağlar. Bu yöntem, hızlandırılmış mikroskopi ve canlı hücre görüntüleme odalarının ekipman yoğun yöntemlerini kullanmak yerine, yaygın ol…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma Ödülü #81XWH-16-1-0710, Mississippi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi ve BiyoMoleküler Bilimler Bölümü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
Riferimenti
- Gilbert, S. F. . Developmental biology. , (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
