Détection de l’expression de microARN dans les reins de souris néphropathiques immunoglobulines A
Summary
Les microARN sont impliqués dans la pathogenèse de la néphropathie à IgA. Nous avons développé une méthode fiable pour détecter les niveaux d’expression des microARN dans les reins d’un modèle murin de néphropathie à IgA (souris HIGA). Cette nouvelle méthode facilitera la vérification de l’implication des miARN dans la néphropathie à IgA.
Abstract
La néphropathie à immunoglobuline A (IgA) est un type de glomérulonéphrite primaire caractérisée par le dépôt anormal d’IgA, conduisant à l’insuffisance rénale terminale. Ces dernières années, l’implication des microARN (miARN) a été rapportée dans la pathogenèse de la néphropathie à IgA. Cependant, il n’existe pas de méthode établie pour profiler les miARN dans la néphropathie à IgA à l’aide de modèles de petits animaux. Par conséquent, nous avons développé une méthode fiable pour analyser les miARN dans le rein d’un modèle murin IgA (souris HIGA). L’objectif de ce protocole est de détecter les niveaux d’expression altérés des miARN dans les reins des souris HIGA par rapport aux niveaux dans les reins des souris témoins. En bref, cette méthode comprend quatre étapes: 1) l’obtention d’échantillons de reins de souris HIGA; 2) purifier l’ARN total des échantillons de reins; 3) synthétiser l’ADN complémentaire à partir de l’ARN total; et 4) la réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse (qRT-PCR) des miARN. En utilisant cette méthode, nous avons réussi à détecter les niveaux d’expression de plusieurs miARN (miR-155-5p, miR-146a-5p et miR-21-5p) dans les reins de souris HIGA. Cette nouvelle méthode peut être appliquée à d’autres études de profilage des miARN dans la néphropathie à IgA.
Introduction
La néphropathie à immunoglobuline A (IgA) est un type de glomérulonéphrite primaire caractérisée par le dépôt anormal d’IgA dans la région mésangiale glomérulairerénale 1,2. C’est la glomérulonéphrite primaire la plus fréquente et conduit à l’insuffisance rénale terminale chez 20 à 40 % des patients2. La cause est encore inconnue mais une infection muqueuse persistante a été impliquée 1,3. Des corticostéroïdes, des immunosuppresseurs et des inhibiteurs du système rénine-angiotensine ont été proposés comme méthodes thérapeutiques1,3, mais n’ont pas été complètement établis3. Par conséquent, d’autres recherches sont nécessaires pour clarifier l’étiologie et les méthodes thérapeutiques de traitement de la néphropathie à IgA.
Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants qui jouent un rôle important dans la régulation de l’expression génique 4,5. Les miARN seraient impliqués dans la pathogenèse de diverses maladies, et certains ont été identifiés comme biomarqueurs de maladies et agents thérapeutiques 4,5. Au cours des dernières années, une association entre les miARN et la pathogenèse de la néphropathie à IgA a également été rapportée 2,6,7. Par exemple, miR-148b s’est avéré impliqué dans les anomalies structurelles des IgA chez les patients atteints de néphropathie à IgA 2,6,7, tandis que miR-148b et let-7b ont été documentés en tant que nouveaux biomarqueurs pour la détection de la néphropathie à IgA7. Bien que la compréhension des effets des miARN sur la néphropathie à IgA puisse aider à élucider davantage l’étiologie et le traitement 2, les méthodes standard pour profiler les miARN dans la néphropathie à IgA à l’aide de modèles de petits animaux n’ont pas encore été établies2.
Nous avons développé ici une méthode simple et fiable pour mesurer les niveaux d’expression des miARN dans les reins d’un modèle murin de néphropathie à IgA (souris HIGA). La souris HIGA est une souche caractéristique de ddY présentant un taux particulièrement élevé d’IgA sériques et le dépôt anormal d’IgA dans les glomérulesrénaux 8,9,10,11. Par conséquent, les souris HIGA peuvent être utilisées comme souris néphropathie à IgA modèle 8,9,10,11. Notre méthode comprend quatre étapes principales: premièrement, l’obtention chirurgicale d’échantillons de reins de souris HIGA; deuxièmement, homogénéiser les échantillons et purifier l’ARN total à l’aide d’une colonne de spin à membrane de silice; troisièmement, synthétiser l’ADN complémentaire (ADNc) à partir de l’ARN total en utilisant la transcription inverse; et quatrièmement, la détection des niveaux d’expression des miARN par réaction en chaîne de la polymérase à transcription inverse quantitative (qRT-PCR). La justification de cette méthode et la fiabilité des résultats sont fondées sur des rapports antérieurs12,13. Nous montrons qu’il s’agit d’une technique utile pour mesurer avec précision les niveaux d’expression des miARN dans un modèle murin de néphropathie à IgA, et qu’elle pourrait être utilisée pour faciliter les recherches futures sur les miARN dans la néphropathie à IgA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons pu mesurer les niveaux d’expression des miARN dans les reins d’un modèle murin de néphropathie à IgA (souris HIGA) en utilisant cette nouvelle méthode. La néphropathie à IgA est une maladie inexpliquée qui nécessite des recherches supplémentaires pour clarifier son étiologie et ses cibles thérapeutiques 1,3. Cependant, l’obtention d’échantillons de rein humains est très invasive. Cette nouvelle technique est avantageuse en ce qu’…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Sarah Williams, PhD, d’Edanz Group (www.edanzediting.com) pour avoir édité une ébauche de ce manuscrit.
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
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