Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen
Summary
Dieser Artikel bietet eine detaillierte Methodik für Gewebedissoziation und zelluläre Fraktionierungsansätze, die die Anreicherung lebensfähiger Epithelzellen aus proximalen und distalen Regionen der menschlichen Lunge ermöglichen. Hierin werden diese Ansätze für die funktionelle Analyse von Lungenepithel-Vorläuferzellen durch den Einsatz von 3D-Organoid-Kulturmodellen angewendet.
Abstract
Epithel-Organoid-Modelle dienen als wertvolle Werkzeuge, um die grundlegende Biologie eines Organsystems zu untersuchen und Krankheiten zu modellieren. Wenn sie als Organoide gezüchtet werden, können sich epitheliale Vorläuferzellen selbst erneuern und differenzierende Nachkommen erzeugen, die zelluläre Funktionen aufweisen, die denen ihrer In-vivo-Gegenstücke ähneln. Hierin beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um regionsspezifische Vorläufer aus der menschlichen Lunge zu isolieren und 3D-Organoidkulturen als experimentelles und validierendes Werkzeug zu generieren. Wir definieren proximale und distale Regionen der Lunge mit dem Ziel, regionsspezifische Vorläuferzellen zu isolieren. Wir nutzten eine Kombination aus enzymatischer und mechanischer Dissoziation, um Gesamtzellen aus Höhle und Luftröhre zu isolieren. Spezifische Vorläuferzellen wurden dann aus den proximalen oder distalen Ursprungszellen mittels fluoreszenzassoziierter Zellsortierung (FACS) auf der Grundlage von zelltypspezifischen Oberflächenmarkern wie NGFR für die Sortierung von Basalzellen und HTII-280 für die Sortierung von alveolären Typ-II-Zellen fraktioniert. Isolierte basale oder alveoläre Typ-II-Vorläufer wurden verwendet, um 3D-Organoidkulturen zu erzeugen. Sowohl distale als auch proximale Vorläufer bildeten Organoide mit einer koloniebildenden Effizienz von 9-13% in der distalen Region und 7-10% in der proximalen Region, wenn sie am 30. Tag 5000 Zellen / Well plattiert wurden. Distale Organoide hielten HTII-280+ alveoläre Typ-II-Zellen in Kultur, während proximale Organoide bis zum 30. Tag in flimmer- und sekretorische Zellen differenzierten. Diese 3D-Organoidkulturen können als experimentelles Werkzeug zur Untersuchung der Zellbiologie von Lungenepithel- und epithelialen mesenchymalen Interaktionen sowie für die Entwicklung und Validierung therapeutischer Strategien zur Bekämpfung der epithelialen Dysfunktion bei einer Krankheit verwendet werden.
Introduction
Lufträume des menschlichen Atmungssystems können grob in leitende und respiratorische Zonen unterteilt werden, die den Transport von Gasen und deren anschließenden Austausch über die epithelial-mikrovaskuläre Barriere vermitteln. Die leitenden Atemwege umfassen Luftröhren, Bronchien, Bronchiolen und terminale Bronchiolen, während Atemlufträume respiratorische Bronchiolen, Alveolargänge und Alveolen umfassen. Die Epithelauskleidung dieser Lufträume ändert ihre Zusammensetzung entlang der proximo-distalen Achse, um den einzigartigen Anforderungen jeder funktional unterschiedlichen Zone gerecht zu werden. Das pseudostratifizierte Epithel der tracheo-bronchialen Atemwege besteht aus drei Hauptzelltypen, basal, sekretorisch und ziliiert, zusätzlich zu den weniger häufigen Zelltypen, einschließlich Bürsten, neuroendokrinen und Ionozyten 1,2,3. Bronchioläre Atemwege beherbergen morphologisch ähnliche Epithelzelltypen, obwohl es Unterschiede in ihrer Häufigkeit und ihren funktionellen Eigenschaften gibt. Zum Beispiel sind Basalzellen in bronchiolären Atemwegen weniger häufig, und sekretorische Zellen umfassen einen größeren Anteil an Clubzellen im Vergleich zu serösen und Kelchzellen, die in Tracheo-Bronchial-Atemwegen vorherrschen. Epithelzellen der Atemzone umfassen einen schlecht definierten quaderförmigen Zelltyp in respiratorischen Bronchiolen, zusätzlich zu alveolären Typ-I- (ATI) und Typ-II- (ATII) -Zellen von Alveolargängen und Alveolen 1,4.
Die Identität von Epithelstamm- und Vorläuferzelltypen, die zur Erhaltung und Erneuerung von Epitheln in jeder Zone beitragen, wird unvollständig beschrieben und weitgehend aus Studien in Tiermodellenabgeleitet 5,6,7,8. Studien an Mäusen haben gezeigt, dass entweder Basalzellen pseudostratifizierter Atemwege oder Keulenzellen bronchiolärer Atemwege oder ATII-Zellen des Alveolarepithels als epitheliale Stammzellen dienen, basierend auf der Fähigkeit zur unbegrenzten Selbsterneuerung und multipotenten Differenzierung 7,9,10,11,12 . Trotz der Unfähigkeit, genetische Linienverfolgungsstudien durchzuführen, um die Stammheit menschlicher Lungenepithelzelltypen zu beurteilen, bietet die Verfügbarkeit von Organoid-basierten Kulturmodellen zur Beurteilung des funktionellen Potenzials von Epithelstamm- und Vorläuferzellen ein Werkzeug für vergleichende Studien zwischen Maus und Mensch 13,14,15,16,17.
Wir beschreiben Methoden zur Isolierung von Epithelzelltypen aus verschiedenen Regionen der menschlichen Lunge und deren Kultur unter Verwendung eines 3D-Organoidsystems, um die regionalen Zelltypen zu rekapitulieren. Ähnliche Methoden wurden für die Funktionsanalyse und Krankheitsmodellierung von Epithelzellen aus anderen Organsystemenentwickelt 18,19,20,21. Diese Methoden bieten eine Plattform für die Identifizierung regionaler epithelialer Vorläuferzellen, für die Durchführung mechanistischer Studien, die ihre Regulation und Mikroumgebung untersuchen, sowie für die Krankheitsmodellierung und Wirkstoffforschung. Obwohl Studien an Lungenepithel-Vorläuferzellen, die in Tiermodellen durchgeführt wurden, von der Analyse profitieren können, entweder in vivo oder in vitro, waren die Erkenntnisse über die Identität menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen weitgehend von der Extrapolation von Modellorganismen abhängig. Als solche bieten diese Methoden eine Brücke, um die Identität und das Verhalten menschlicher Lungenepithelzelltypen mit ihren Studien zur Regulation von Stamm- / Vorläuferzellen in Beziehung zu setzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung definierter Subpopulationen von Lungenzellen aus menschlichem Lungengewebe für die molekulare oder funktionelle Analyse und Krankheitsmodellierung. Kritische Elemente der Methoden sind die Fähigkeit, eine Gewebedissoziation unter Konservierung von Oberflächenepitopen zu erreichen, die eine Antikörper-vermittelte Anreicherung frisch isolierter Zellen ermöglichen, und die Optimierung von Kulturmethoden für die effiziente Erzeugung von regionsspezifischen Epith…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir schätzen die Unterstützung von Mizuno Takako für die IFC- und H- und E-Färbung, Vanessa Garcia für die Gewebeschnitte und Anika S Chandrasekaran für die Unterstützung bei der Manuskriptvorbereitung. Diese Arbeit wird von den National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) und dem Celgene IDEAL Consortium unterstützt.
Materials
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 | ||
Riferimenti
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