Isolamento e enriquecimento de células progenitoras epiteliais pulmonares humanas para a cultura organoide
Summary
Este artigo fornece uma metodologia detalhada para as abordagens de dissociação tecidual e fracionamento celular permitindo o enriquecimento de células epiteliais viáveis de regiões proximais e distais do pulmão humano. Aqui essas abordagens são aplicadas para a análise funcional das células progenitoras epiteliais pulmonares através do uso de modelos de cultura organoides 3D.
Abstract
Modelos organoides epiteliais servem como ferramentas valiosas para estudar a biologia básica de um sistema de órgãos e para modelagem de doenças. Quando cultivadas como organoides, as células progenitoras epiteliais podem se auto-renovar e gerar progêneres diferenciais que exibem funções celulares semelhantes às de suas contrapartes in vivo . Aqui descrevemos um protocolo passo-a-passo para isolar progenitores específicos da região do pulmão humano e gerar culturas organoides 3D como uma ferramenta experimental e de validação. Definimos regiões proximais e distais do pulmão com o objetivo de isolar células progenitoras específicas da região. Utilizamos uma combinação de dissociação enzimática e mecânica para isolar células totais do pulmão e da traqueia. Células progenitoras específicas foram então fracionadas das células de origem proximal ou distal usando fluorescência de classificação celular associada (FACS) com base em marcadores de superfície específicos do tipo celular, como NGFR para classificação de células basais e HTII-280 para classificação de células alveolares tipo II. Progenitores basais isolados ou alveolares tipo II foram utilizados para gerar culturas organoides 3D. Tanto progenitores distal quanto proximal formaram organoides com uma colônia formando eficiência de 9-13% na região distal e 7-10% na região proximal quando banhados 5000 células/poços no dia 30. Organoides distais mantiveram células alveolares tipo II HTII-280+ na cultura, enquanto organoides proximais se diferenciaram em células ciliadas e secretary até o dia 30. Essas culturas organoides 3D podem ser utilizadas como uma ferramenta experimental para estudar a biologia celular das interações mesenquimais pulmonares e epiteliais, bem como para o desenvolvimento e validação de estratégias terapêuticas voltadas à disfunção epitelial em uma doença.
Introduction
Os espaços aéreos do sistema respiratório humano podem ser amplamente divididos em zonas de condução e respiratória que mediam o transporte de gases e sua subsequente troca através da barreira epitelial-microvascular, respectivamente. As vias aéreas condutoras incluem traqueia, brônquios, brônquios e brônquios terminais, enquanto os espaços de ar respiratório incluem brônquios respiratórios, dutos alveolares e alvéolos. O revestimento epitelial desses espaços aéreos muda na composição ao longo do eixo proximo-distal para acomodar os requisitos únicos de cada zona funcionalmente distinta. O epitélio pseudoesstratificado das vias aéreas traqueo-brônquico é composto por três tipos de células principais, basal, secreto e ciliado, além dos tipos celulares menos abundantes, incluindo escova, neuroendócrina e ionócito 1,2,3. As vias aéreas bronquiolares abrigam tipos de células epiteliais morfologicamente semelhantes, embora haja distinções em suas propriedades abundantes e funcionais. Por exemplo, as células basais são menos abundantes dentro das vias aéreas bronquiolares, e as células secretas incluem uma maior proporção de células de clube versus células de cálice e cálice que predominam nas vias aéreas traqueo-brônquicas. As células epiteliais da zona respiratória incluem um tipo de célula cuboidal mal definida em brônquios respiratórios, além de células alveolares tipo I (ATI) e tipo II (ATII) de dutos alveolares e alveoli 1,4.
A identidade dos tipos de células epiteliais e progenitoras que contribuem para a manutenção e renovação da epitelial em cada zona são incompletamente descritas e em grande parte inferidas a partir de estudos em modelos animais 5,6,7,8. Estudos em camundongos têm mostrado que ou células basais de vias aéreas pseudoestratificadas, ou células de clubes de vias aéreas bronquiolares ou células ATII do epitélio alveolar, servem como células-tronco epiteliais baseadas na capacidade de autoconexação ilimitada e diferenciação multipotente 7,9,10,11,12 . Apesar da incapacidade de realizar estudos de rastreamento de linhagem genética para avaliar a origem dos tipos de células epiteliais pulmonares humanas, a disponibilidade de modelos de cultura baseados em organoides para avaliar o potencial funcional das células-tronco epiteliais e progenitoras fornece uma ferramenta para estudos comparativos entre camundongos ehumanos 13,14,15,16,17.
Descrevemos métodos para o isolamento de tipos de células epiteliais de diferentes regiões do pulmão humano e sua cultura usando um sistema organoide 3D para recapitular os tipos de células regionais. Métodos semelhantes foram desenvolvidos para a análise funcional e modelagem de doenças de células epiteliais de outros sistemas de órgãos 18,19,20,21. Esses métodos fornecem uma plataforma para a identificação de células progenitoras epiteliais regionais, para realizar estudos mecanicistas investigando sua regulação e microambiente, e para permitir a modelagem de doenças e descoberta de medicamentos. Embora estudos de células progenitoras epiteliais pulmonares realizados em modelos animais possam se beneficiar da análise, seja in vivo ou in vitro, insights sobre a identidade das células progenitoras epiteliais pulmonares humanas têm sido em grande parte dependentes da extrapolação de organismos modelo. Como tal, esses métodos fornecem uma ponte para relacionar a identidade e o comportamento dos tipos de células epiteliais pulmonares humanas com seus estudos investigando a regulação de células-tronco/progenitoras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos um método confiável para o isolamento de subpopulações definidas de células pulmonares do tecido pulmonar humano para análise molecular ou funcional e modelagem de doenças. Elementos críticos dos métodos incluem a capacidade de alcançar a dissociação tecidual com a preservação de epítopos superficiais, que permitem o enriquecimento mediado por anticorpos de células recém-isoladas, e a otimização de métodos culturais para a geração eficiente de organoides epiteliais específicos da regiã…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o apoio de Mizuno Takako para a coloração do IFC e H e E, Vanessa Garcia para seção de tecidos e Anika S Chandrasekaran por ajudar na preparação do manuscrito. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) e Consórcio Celgene IDEAL.
Materials
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 | ||
Riferimenti
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