Denne protokol giver en omfattende procedure for fremstilling af humane iPS celle-afledte motoriske nerve organoid gennem spontan samling af en robust bundt axoner udvidet fra en sfæroid i en vævskultur chip.
En fascicle af axoner er en af de vigtigste strukturelle motiver observeret i nervesystemet. Forstyrrelse af axon fascicles kan forårsage udviklingsmæssige og neurodegenerative sygdomme. Selv om der er gennemført talrige undersøgelser af axoner, er vores forståelse af dannelse og dysfunktion af axon fascicles stadig begrænset på grund af manglen på robuste tredimensionelle in vitro-modeller. Her beskriver vi en trinvis protokol for den hurtige generation af en motornerveorganoid (MNO) fra human inducerede pluripotente stamceller (iPS) celler i en mikrofluidisk-baseret vævskulturchip. For det første beskrives fremstilling af chips, der anvendes til metoden. Fra menneskelige iPS-celler dannes en motor neuron sfæroid (MNS). Dernæst overføres den differentierede MNS til chippen. Derefter vokser axoner spontant ud af kugleformet og samles i en fascicle i en mikrokanal udstyret i chippen, som genererer et MNO-væv, der bærer et bundt axoner forlænget fra kugleformet. Til downstream-analysen kan MPO’er tages ud af chippen, der skal fastgøres til morfologiske analyser eller dissekeres til biokemiske analyser, samt calciumbilleddannelse og multielektrode array-optagelser. MNOs genereret med denne protokol kan lette test og screening af lægemidler og kan bidrage til forståelsen af mekanismer, der ligger til grund for udvikling og sygdomme i axon fascicles.
Spinal motor neuroner (MN) udvide axoner til skeletmuskler til at kontrollere kroppens bevægelse. Deres axonale baner er højt organiserede og regulerede i udviklingsprocessen. På trods af mange undersøgelser af axonforlængelse og vejledning1undersøges der stadig mekanismer til organiseret axonbundtdannelse. Axoner af motoriske neuroner er ofte beskadiget af neurodegenerative sygdomme som amyotrofisk lateral sklerose (ALS)2, men patofysiologiske mekanismer af skaden på axon fascicles er dårligt forstået. Således kræves en fysiologisk og patologisk model til at opsummere axon bundtdannelse og regression i marken.
En menneskelig stamcelle-afledt motor neuron er en lovende platform for forståelse af udvikling og sygdomme som ALS3. Menneskeskabte pluripotente stamceller (iPS-celler) kan bruges til at modellere sygdomme ved hjælp af patient-afledte celler. Til dato er forskellige differentieringsmetoder fra pluripotente stamceller til MN blevet rapporteret4,5,6. Imidlertid er axoner af neuroner i todimensionel kultur tilfældigt orienteret og sammenfatter ikke in vivo mikromiljø inden for udvikling af nerver, hvor axoner er ensrettet samlet gennem tætte axo-axonale interaktioner7. For at løse dette problem har vi udviklet en teknik til at generere et tredimensionelt væv, der ligner motornerven fra menneskelige iPS-celler8, og navngivet vævet som motornerveorganoid (MNO). MNO består af cellelegemer placeret i en motor neuron sfæroid (MNS) og en axonal fascicle forlænget ud fra kugleformet. Axonerne i fascicleen er ensrettet, hvilket ligner axoner i udviklingen af motoriske nerver. Derfor giver MPO’er unikt et fysiologisk axonalt mikromiljø, som ikke blev udført af andre tidligere udviklede neuronale kulturmetoder.
I denne protokol beskriver vi metoder til vævskultur chips fabrikation, hurtig motor neuron differentiering, og motor nerve organoid dannelse i udviklede chips. Vores vævskulturchip er meget enkel, og den indeholder kun et rum til accept af en kugleformet, en mikrokanal til dannelse af et axonbundt og et rum til boliger axonterminaler. Enheden indeholder ikke komplekse strukturer, herunder mikrogrooves eller micropore filtre, der ofte bruges til at adskille axoner og cellelegemer efter størrelse9,10. Derfor kan vores enheder let fremstilles ved at følge de trin, der er beskrevet i denne protokol, hvis en fotolitografiopsætning er tilgængelig.
Hurtig differentiering af menneskelige iPS-celler opnås med en optimeret kombination af inducerende og mønstrende faktorer (SB431542, LDN-193189, retinosyre (RA) og glattet agonist (SAG)) og accelerationsfaktorer (SU5402 og DAPT). Det er blevet rapporteret, at kombinationen af SU5402 og DAPT fremskynder differentieringen af perifere neuroner og neurale crest celler11. I denne protokol tilbyder vi tre forskellige metoder til at generere MPO’er, så læserne kan beslutte sig for en metode, der passer bedst til deres behov. Vi anbefaler at udføre differentiering af menneskelige iPS-celler efter at have dannet en sfæroid (3D-metoden), da den differentierede MNS kan overføres direkte til en vævskulturchip. Alternativt kan menneskelige iPS-celler differentieres til motoriske neuroner i monolayer (2D) kultur og derefter oprettes i tredimensionelle motor neuron-sfæroider, som vi tidligere rapporterede8. Vi har opdateret protokollen, og med den tredimensionelle differentieringsmetode, der er beskrevet i denne protokol, kan overgangen fra 2D til 3D undgås, og MPO’er kan opnås med kortere differentieringstid, færre trin og reducerede tekniske risici uden dissociationstrinet. Kommercielt tilgængelige neuroner kan også bruges til at generere MNS for at reducere tiden til differentiering.
For at generere en MNO dyrkede vi en MNS i vævskulturchippen. Axonerne forlænges fra kugleformen og strækker sig ind i mikrokanalen, hvor axoner samles og justeres ensrettet. Dette letter axo-axonal interaktion og spontan dannelse af et tæt samlet ensrettet bundtvæv af axoner i mikrokanalen, hvilket unikt opnås ved denne protokol, mens enten spontan bundtdannelse eller styret axonal orientering alene kan opnås ved andre protokoller12,13,14. I et typisk eksperiment migrerer få celler ud fra sfæroider til mikrokanalen, og de fleste celler forbliver i nærheden af sfæroider. Denne metode gør det muligt spontant at adskille axoner fra spheroiderne uden at anvende størrelsesafhængige fysiske barrierer (f.eks. mikrogrooves eller microporefiltre) til at adskille axoner fra cellelegemer.
Den resulterende MNO kan underkastes forskellige undersøgelser, herunder morfologiske, biokemiske og fysiske analyser. Cellekroppen og det udvidede axonbundt kan fysisk isoleres ved skæring og kan analyseres separat til downstream-eksperimenter, f.eks. biokemiske assays. Biologiske materialer, herunder RNA og protein kan isoleres fra blot et par axon bundter til regelmæssige biokemiske assays herunder RT-PCR og vestlige blotting. Her beskriver vi en protokol til generering af motornerveorganoid fra iPS-celler, som tilbyder en attraktiv fysiologisk og patologisk model til at studere den mekanisme, der ligger til grund for udvikling og sygdom af axon fascicles.
Denne protokol beskriver dannelsen af en motor nerve organoid (MNO), som har en axon bundt forlænget fra en motor neuron sfæroid genereret fra menneskelige iPS celler. Det dannede axonbundt er tykt, fleksibelt og velorganiseret i ensrettede strukturer. Ved at dissekere axonbundtet kan der opnås axonalt protein og RNA med høj renhed tilstrækkeligt til biokemiske analyser. Neuronal aktivitet kan måles i axon bundter og sfæroider med calcium billeddannelse. Forurening af nukleare og dendritiske proteiner i axonal lysatet blev ikke opdaget ved vestlig blotting, hvilket viser, at vores metode effektivt adskilt axoner fra cellelegemer og dendritter.
En af fordelene ved denne protokol er den hurtige differentiering og generering af MNO udstyret med et axonbundt, hvor alle processer kan udføres på 4 uger med 3D-protokollen og 5-6 uger ved hjælp af 2D-protokollen. Dette er kort i forhold til andre protokoller, som typisk tager 3-4 uger blot at differentiere til MN fra embryonale stamceller og iPS-celler17, og det tager yderligere 2-4 uger at opnå axonal forlængelse. 3D-protokollen foretrækkes generelt frem for 2D-protokollen på grund af den kortere differentieringstid, færre trin og reducerede tekniske risici uden dissociationstrinnet sammenlignet med 2D-protokollen. Den mikrofluidic-baserede vævskultur chip blev designet på en måde, så axoner af MNS kan forlænge mod det andet rum gennem mikrokanalen, hvilket letter dannelsen af et bundt axoner ved at fremkalde axo-axonale interaktioner og affinitet mellem axoner. På grund af den enkle eksperimentelle opsætning kan alle de protokoller, der er beskrevet her, ikke kun udføres af bioengineers, der er bekendt med manipulation af en vævskulturchip, men også biologer og neuroforskere, der ikke er bekendt med mikrofluidics og mikrofabrikationsteknikker. Det skal bemærkes, at trin 1 og 2 også kan udføres ved hjælp af en ekstern fabrikationsservice.
Et af de kritiske skridt til at opnå protokollen er en sekventiel ændring af kulturmediet. Det anbefales helt at ændre kulturmediet på hvert trin under differentieringen, så faktorer i det brugte medium ikke forstyrrer MN-differentieringen. Et andet kritisk punkt i denne protokol er at opretholde udifferentierede iPS-celler i god kvalitet. Kvaliteten af den oprindelige iPS cellekultur påvirker effektiviteten for at opnå motoriske neuroner og MNO. Et andet punkt er, at diameteren af MNS skal være mindre end størrelsen af hullet i chippen (1,5 mm). Større sfæroider kan ikke komme ind i kammeret, og potentielt opleve svær hypoxisk nekrose i den midterste del. Størrelsen af MNS’er kan styres ved at ændre et indledende såningsnummer af iPS-celler (i 3D-protokol) eller motoriske neuroner (i 2D-protokol). Cellernes såtæthed skal optimeres for hver iPS-cellelinje.
Opdelte mikrofluidiske enheder med mikrogrooves og små porefiltre er i vid udstrækning blevet brugt til at adskille axoner fra cellelegemer og dendritter. Denne teknik kan også adskille axoner fra celle organer og dendrite, med overlegen overflod af axoner i bundtet væv. Sammenlignet med de andre metoder er en væsentlig begrænsning af denne metode, at den ikke kan adskille to forskellige kulturmedier i det nuværende design af vævskulturchippen, hvilket hindrer evnen til medkultur af to forskellige celler, der kræver to forskellige medier. En anden begrænsning er, at PDMS-chippen sætter forudbestemt begrænsning på vævets størrelse. En kugleformet større end hullet kan ikke komme ind i kammeret, og axonbundtet kan ikke blive tykkere end bredden af mikrofluidisk kanal.
Denne metode kan anvendes til andre typer af neuroner. Vores gruppe har vist evne til at modellere en cerebral tarmkanalen ved hjælp af en modificeret metode kombineret med cerebral organoid teknikker18. Kortikale sfæroider blev introduceret i både rum og axoner spontant langstrakt gensidigt mod hver sfæroid, og efterfølgende en axon bundt dannet spontant. Som følge heraf kan to kortikale sfæroider forbindes gennem et axonbundt, og vævet kan opnås som et stykke. Dette viser, at tilgangen er meget alsidig til at danne axon bundtvæv uanset neuronale celletyper. I denne protokol blev der imidlertid anvendt menneskelige iPS-celler, men andre stamceller, herunder menneskelige ES-celler og menneskelige neurale stamceller, kan bruges med ændringer af den præsenterede protokol. 3D-sfæroider af neuroner kan genereres af forskellige protokoller19,20. Denne metode til fremstilling af væv med en axon bundt kan potentielt kombineres i fremtiden med de andre differentiering protokoller for at gøre 3D MN sfæroid. Derudover kan tykkelsen og længden af axonbundtet styres ved blot at ændre bredden og højden af vævskulturchippen til fremtidig udvikling.
Vi mener, at denne protokol kan bruges til test og screening af lægemidler og kan bidrage til forståelsen af de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen og sygdomme i axon fascicles.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 og 18K19903, Core-2-core program, og Beyond AI institut.
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
Accutase | ICT | AT104 | |
B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
DAPT | Sigma | D5942 | |
DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
HBSS | Wako | 085-09355 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
SAG | Sigma | SML1314 | |
SB431542 | Wako | 192-16541 | |
Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
SU5402 | Sigma | SML0443 | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
Y-27632 | Wako | 030-24021 |