CD47由来ペプチド固定化による金属インプラントへの血液媒介性細胞の取り付けの軽減
Summary
ここで提示されるペプチドCD47(pepCD47)をポリビスフォスフォネート化学を用いて金属ステントに付加するためのプロトコルです。pepCD47を用いた金属ステントの機能化は、炎症細胞の付着および活性化を防止し、生体適合性を向上させる。
Abstract
ベアメタルステントと薬物溶出ステントに関連する主要な合併症は、それぞれステント内のレステノーシスと後期ステント血栓症です。したがって、金属ステントの生体適合性の向上は依然として重要な課題である。このプロトコルの目的は、血管内ステントを含む医療インプラントに接触する血液の生体適合性を高めるために生物学的に活性なペプチドによる金属表面修飾の堅牢な技術を記述することです。CD47は、自己の免疫学的種特異的マーカーであり、抗炎症特性を有する。研究は、細胞外領域におけるCD47のIgドメインに対応する22アミノ酸ペプチド(pepCD47)が、全長タンパク質のような抗炎症特性を有することを示している。ラットのインビボ研究、および私たちの研究室からのウサギおよびヒト血液実験システムにおけるex vivo研究は、金属に対するpepCD47固定化が炎症性細胞の付着および活性化を防ぐことによって生体適合性を向上させることを実証した。本論文では、金属表面の機能化とペプチド付着のステップバイステッププロトコルについて説明する。金属表面は、ポリアリアアミンビスリン酸を使用して修飾され、後にチオールの脱保護およびピリジルジチオ基(PEI-PDT)を搭載したポリエチレンイアミンとの反応によるチオール反応性部位の増幅が続く。最後に、pepCD47は、二重8-アミノ-3,6-dioxa-オクタノイルスペーサーを介してコアペプチド配列に接続された末端システイン残基を組み込んで、ジスルフィド結合を介して金属表面に結合される。この金属表面へのペプチド付着の方法論は効率的で比較的安価であり、したがって、いくつかの金属生体材料の生体適合性を改善するために適用することができる。
Introduction
経皮的冠動脈介入は、冠動脈疾患(CAD)を治療するための治療の第一行であり、主に疾患のある動脈をステント化することを含む。しかし、ステント内のレステノーシス(ISR)およびステント血栓症は、ステント展開1に関連する一般的な合併症である。血液ステント界面での血液相互作用は、金属表面上の血漿タンパク質のほぼ即時吸着によって特徴付け、その後に血小板および炎症性細胞の付着および活性化2が続く。活性化された炎症細胞からの炎症性サイトカインおよびケモカインの放出は、チュニカ培地における血管平滑筋細胞(VSMC)の表皮修飾をもたらし、その遠心性インティカルコンパートメントへの移行を引き起こす。インティマにおける活性化VSMCの増殖は、インティミカル層の肥厚、内腔狭化およびステントレステノーシス3をもたらす。VSMCの増殖を防ぐために、薬物溶出ステント(DES)が開発されました。しかしながら、これらの薬物は、内皮細胞44,55に対するオフターゲット細胞傷害作用を有する。したがって、後期ステント血栓症は、DES66,77に関連する一般的な合併症である。ポリ-L-ラクチドのような生分解性ポリマーで作られたステントは、動物実験および初期臨床試験において多くの約束を示したが、「現実の」臨床使用が第3世代DES8に劣っていることを示した時に最終的にリコールされた。したがって、より良い患者の転帰のためにベアメタルステントの生体適合性を改善する必要がある。
CD47は、その同結合受容体シグナル調節タンパク質α(SIRPα)9に結合した場合に自然免疫応答を阻害する、ユビキタスに発現する膜貫通タンパク質である。SIRPα受容体は、免疫細胞チロシン阻害モチーフ(ITIM)ドメインとSIRPα-CD47相互作用のシグナル伝達事象を有し、最終的には炎症性細胞活性化10、11、12、13,12,のダウンレギュレーションをもたらす。10,13我々の研究室での研究は、組換えCD47またはそのペプチド誘導体が、CD47の細胞外領域の22アミノ酸Igドメイン(pepCD47)に相当し、臨床的に関連する生体材料14、15、16,15,16の範囲に対する宿主免疫応答を低下させることができることを示している。最近、pepCD47をステンレス鋼のステント表面に固定化し、修復に伴う病態生理学的応答を大幅に低下させることができることを実証した。なお、pepCD47改質面は、長期保存やエチレンオキシド滅菌法17などの関連する使用条件に適している。そのために、pepCD47は、血管内ステントの臨床的限界に対処するのに有用な治療標的であり得る。
pepCD47を金属表面に共有結合させる戦略は、金属表面の一連の新しい化学修飾を伴う。金属表面は、まずポリアリンアミンビスホスホネートを潜伏チオール基(PABT)でコーティングし、続いてチオールの脱保護とピリジルジチオ基(PDT)を搭載したポリエチレンイミン(PEI)の付着物を施した。脱保護PABTチオールとの反応で消費されないPEIのPDT基は、次いで、末端システイン残基にチオールを組み込んだpepCD47と反応し、ジスルフィド結合14、17、18,17,18を介してpepCD47を金属表面に結合させる。ペプチドの最大表面固定化をもたらすペプチドの入力濃度を求めるフルオロフォア共役pepCD47(TAMRA-pepCD47)を用いた。最後に、pepCD47被覆金属表面の急性および慢性抗炎症能力を評価し、ex vivo、チャンドラーループ装置、及び単球接続/マクロファージ拡張アッセイを用いてそれぞれ評価した。
本論文は、金属表面へのチオラ化ペプチドの付着のための系統的なプロトコルを提供する。ペプチドの最大固定化密度を決定する;全血および単球に曝露されたpepCD47被覆金属表面の抗炎症特性を評価する。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、血液中に見られる炎症細胞に対する表面の反応性を低下させるという包括的な目標を持つステンレス鋼表面に治療ペプチド部分を付加する比較的新しい化学戦略を実証し、記述する。本明細書に記載されるビスホスホネート化学は、PABTの金属酸化物とビスホスホネート基との間の協調結合形成を含む。金属表面に形成されるポリビスホスホネート単層の厚さは5nm18?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本論文で発表されたプロトコルの開発と研究は、IFおよびSJSへのNIH(NBIB)R01資金(#EB023921)、IFおよびRJLへのNIH(NHLBI)R01資金(#HL137762)によって支えられました。
Materials
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH – 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
Riferimenti
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