التخفيف من مرفق الخلايا المنقولة بالدم إلى يزرع المعادن من خلال CD47-المشتقة الببتيد تجميد
Summary
هنا هو بروتوكول لإلحاق CD47 الببتيد (pepCD47) إلى الدعامات المعدنية باستخدام الكيمياء polybisphosphonate. وظيفية من الدعامات المعدنية باستخدام pepCD47 يمنع المرفق وتفعيل الخلايا الالتهابية وبالتالي تحسين التوافق الحيوي.
Abstract
المضاعفات الرئيسية المرتبطة الدعامات المعدنية العارية والدعامات التي تُمَرّد المخدرات هي إعادة الدعامات في الدعامات والتخثر الدعامات المتأخر، على التوالي. وبالتالي، فإن تحسين التوافق الحيوي للدعامات المعدنية لا يزال يشكل تحديا كبيرا. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف تقنية قوية لتعديل السطح المعدني بواسطة الببتيدات النشطة بيولوجيا لزيادة التوافق الحيوي للدم الاتصال يزرع الطبية، بما في ذلك الدعامات داخل الأوعية الدموية. CD47 هو علامة مناعية خاصة بالأنواع الذاتية ولها خصائص مضادة للالتهابات. وقد أظهرت الدراسات أن 22 ببتيد الأحماض الأمينية المقابلة للمجال Ig من CD47 في المنطقة خارج الخلية (pepCD47), له خصائص مضادة للالتهابات مثل البروتين كامل الطول. في دراسات الجسم الحي في الفئران، ودراسات الجسم الحي السابق في الأرانب وأنظمة الدم البشري التجريبية من مختبرنا قد أظهرت أن pepCD47 شل الحركة على المعادن يحسن التوافق الحيوي عن طريق منع التعلق الخلوية الالتهابية والتنشيط. تصف هذه الورقة البروتوكول خطوة بخطوة لإضفاء الطابع الوظيفي على الأسطح المعدنية ومرفق الببتيد. يتم تعديل الأسطح المعدنية باستخدام البايفوسفات بوليولامين مع مجموعات الثيول الكامنة (PABT) تليها إزالة البروتكشن من الثيول وتضخيم المواقع الثيول التفاعلية عن طريق رد فعل مع البولي إثيلينمين مثبتة مع مجموعات بيريديلديثيو (PEI-PDT). وأخيرا، pepCD47، دمج بقايا السيستين المحطة متصلة تسلسل الببتيد الأساسية من خلال المزدوج 8-أمينو-3،6-ديوكسا-أوكتانويل الفضاء، تعلق على السطح المعدني عن طريق السندات كبريتيد. هذه المنهجية من التعلق الببتيد إلى سطح معدني فعالة وغير مكلفة نسبيا، وبالتالي يمكن تطبيقها لتحسين التوافق الحيوي من عدة المواد الحيوية المعدنية.
Introduction
التدخل التاجي عن طريق الجلد هو السطر الأول من العلاج لعلاج أمراض الشريان التاجي (CAD) وينطوي في المقام الأول على الدعامات الشرايين المريضة. ومع ذلك، في الدعامات إعادة تناضح (ISR) وجلخ الدعامات هي المضاعفات الشائعة المرتبطة نشر الدعامات1. يتميز تفاعل الدم في واجهة الدعامات الدموية من خلال الامتزاز الفوري تقريبا من بروتينات البلازما على السطح المعدني ، تليها الصفائح الدموية والخلايا الالتهابية مرفق وتفعيل2. يؤدي إطلاق السيتوكينات الالتهابية وchemokines من الخلايا الالتهابية المنشطة إلى تعديل فينوتيبين من خلايا العضلات السلسة الوعائية (VSMCs) في وسائط tunica ويحفز هجرتهم إلى المقصورة الإلتميمية. انتشار VSMC المنشط في نتائج intima في سماكة طبقة intimal ، التجويف تضييق و في الدعامات restenosis3. وقد تم تطوير الدعامات المُستَرَدَة من المخدرات (DES) لمنع انتشار الـ VSMC؛ ومع ذلك، هذه الأدوية لها تأثير خارج الهدف السامة للخلايا على الخلايا البطانية4،5. ولذلك، في وقت متأخر من الخثار الدعامات هو من المضاعفات الشائعة المرتبطة DES6،7. الدعامات المصنوعة من البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي، مثل بولي-L-lactide أظهرت الكثير من الوعد في التجارب الحيوانية والتجارب السريرية الأولية، ولكن تم التذكير في نهاية المطاف عندما “الحياة الحقيقية” الاستخدام السريري أظهرت دونيتها إلى الجيلالثالث DES8. لذلك، هناك حاجة لتحسين التوافق الحيوي للدعامات المعدنية العارية من أجل نتائج أفضل للمريض.
CD47 هو بروتين عبرmembrane أعرب عنه في كل مكان الذي يمنع الاستجابة المناعية الفطرية عندما ملزمة لمستقبلاتها cognate إشارة بروتين ألفا التنظيمية (SIRPα)9. مستقبلات سيربوا لديه الخلايا المناعية التيروزين المثبطة عزر (ITIM) المجال والأحداث إشارة على SIRPα – CD47 التفاعل يؤدي في نهاية المطاف في downregulation من تنشيط الخلايا الالتهابية10,11,12,13. وقد أظهرت الأبحاث في مختبرنا أن CD47 المؤتلف أو مشتق الببتيد، المقابلة ل22 مجال إيغ الأحماض الأمينية من المنطقة خارج الخلية من CD47 (pepCD47)، يمكن أن تقلل من الاستجابة المناعية المضيفة لمجموعة من المواد الحيوية ذات الصلة سريريا14،15،16. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتنا أن pepCD47 يمكن أن تكون مشلولة إلى الأسطح الدعامات الفولاذ المقاوم للصدأ والحد بشكل كبير من الاستجابة المرضية المرتبطة ريسينسيس. ملاحظة، الأسطح المعدلة pepCD47 قابلة لشروط الاستخدام ذات الصلة مثل التخزين على المدى الطويل وتعقيم أكسيد الإيثيلين17. وتحقيقا لهذه الغاية، قد يكون pepCD47 هدفا علاجيا مفيدا لمعالجة القيود السريرية للدعامات داخل الأوعية.
استراتيجية للتعلق التساهمي من pepCD47 إلى سطح معدني ينطوي على سلسلة من التعديلات الكيميائية الجديدة من سطح المعدن. يتم أولا المغلفة الأسطح المعدنية مع البيسفوسفونات بوليولامين مع مجموعات ثيول كامنة (PABT) تليها deprotection من ثيولس ومرفق من البولي ايثيلينمين (PEI) مع مجموعات ثبت pyridyldithio (PDT). مجموعات PDT من PEI unconsumed في رد الفعل مع deprotected PABT thiols ثم تتفاعل مع pepCD47 دمج thiols في بقايا السيستين المحطة الطرفية، مما أدى إلى pepCD47 ملزمة إلى السطح المعدني عن طريق السندات كبريتيد14،17،18. استخدمنا الفلوروفور مترافق pepCD47 (TAMRA-pepCD47) لتحديد تركيز المدخلات من الببتيد الذي يؤدي إلى تثبيت السطح الأقصى من الببتيد. وأخيرا، قمنا بتقييم القدرة الحادة والمزمنة المضادة للالتهابات من الأسطح المعدنية المغلفة pepCD47، والكيفو السابق، وذلك باستخدام جهاز حلقة تشاندلر، وملحق monocyte / مقايسة التوسع الضامة، على التوالي.
توفر هذه الورقة بروتوكولاً منهجياً لتعلق الببتيدات ذات الثياتيد بالسطح المعدني؛ تحديد كثافة الشل الأقصى للببتيد؛ وتقييم خصائص مضادة للالتهابات من الأسطح المعدنية المغلفة pepCD47 المعرضة للدم كله ومحاديات معزولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نبرهن ونصف استراتيجية كيميائية جديدة نسبيا لإلحاق مزيتات الببتيد العلاجية إلى سطح الفولاذ المقاوم للصدأ مع الهدف الشامل للحد من التفاعل السطح مع الخلايا الالتهابية الموجودة في الدم. وتشمل كيمياء البيسفوسفونات الموصوفة هنا تنسيق تكوين السندات بين أكاسيد المعادن ومجموعات البيسفوسفو…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم تطوير البروتوكول والدراسات المقدمة في هذه الورقة من قبل تمويل NIH (NBIB) R01 (# EB023921) إلى IF و SJS ، و NIH (NHLBI) R01 تمويل (# HL137762) إلى IF و RJL.
Materials
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH – 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
Riferimenti
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, 392584 (2013).
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of ‘marker of self’ CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
