Hier gepresenteerd is een protocol voor het toevoegen van peptide CD47 (pepCD47) aan metalen stents met behulp van polybisfosfonaat chemie. Functionalisatie van metalen stents met behulp van pepCD47 voorkomt de bevestiging en activering van ontstekingscellen waardoor hun biocompatibiliteit wordt verbeterd.
De belangrijkste complicaties geassocieerd met bare metal stents en drug eluting stents zijn in-stent restenose en late stent trombose, respectievelijk. Het verbeteren van de biocompatibiliteit van metaalstenten blijft dus een belangrijke uitdaging. Het doel van dit protocol is om een robuuste techniek van metalen oppervlaktemodificatie te beschrijven door biologisch actieve peptiden om de biocompatibiliteit te vergroten van bloedcontacten met medische implantaten, waaronder endovasculaire stents. CD47 is een immunologische soortspecifieke marker van het zelf en heeft ontstekingsremmende eigenschappen. Studies hebben aangetoond dat een 22 aminozuur peptide die overeenkomt met het Ig-domein van CD47 in het extracellulaire gebied (pepCD47), ontstekingsremmende eigenschappen heeft, zoals het volledige eiwit. In vivo studies bij ratten, en ex vivo studies in konijn en menselijk bloed experimentele systemen van ons lab hebben aangetoond dat pepCD47 immobilisatie op metalen verbetert hun biocompatibiliteit door het voorkomen van inflammatoire cel gehechtheid en activering. Dit artikel beschrijft het stapsgewijze protocol voor de functionalisering van metalen oppervlakken en peptidebevestiging. De metalen oppervlakken worden gewijzigd met behulp van polyallylamine bisfosfaat met latente thiolgroepen (PABT), gevolgd door deprotectie van thiolen en versterking van thiol-reactieve locaties via reactie met polyethyleenimine geïnstalleerd met pyridyldithio groepen (PEI-PDT). Ten slotte worden pepCD47, waarin terminale cysteïneresten zijn opgenomen die via een dubbele 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl-spacer op het metalen oppervlak zijn aangesloten, aan het metalen oppervlak bevestigd. Deze methode van peptide bevestiging aan metalen oppervlak is efficiënt en relatief goedkoop en kan dus worden toegepast om de biocompatibiliteit van verschillende metalen biomaterialen te verbeteren.
Percutane coronaire interventie is de eerste lijn van de therapie voor de behandeling van coronaire hartziekten (CAD) en in de eerste plaats gaat stenting de zieke slagaders. Echter, in-stent restenose (ISR) en stent trombose zijn veel voorkomende complicaties in verband met stent inzet1. Bloedinteractie bij de bloedstentinterface wordt gekenmerkt door een bijna onmiddellijke adsorptie van plasma-eiwitten op het metalen oppervlak, gevolgd door bloedplaatjes en ontstekingscelbevestiging en activering2. Het vrijkomen van de inflammatoire cytokines en chemokines uit geactiveerde ontstekingscellen leidt tot de fenotypische modificatie van de vasculaire gladde spiercellen (VSMC’s) in de tunica-media en activeert hun centrimentale migratie naar het intimale compartiment. Proliferatie van geactiveerde VSMC in de intima resulteert in intimale laagverdikking, lumenvernauwing en in-stent restenose3. Drug eluting stents (DES) werden ontwikkeld om VSMC proliferatie te voorkomen; deze geneesmiddelen hebben echter een off-target cytotoxisch effect op de endotheelcellen4,5. Daarom is late stenttrombose een veel voorkomende complicatie in verband met DES6,7. Stents gemaakt van biologisch afbreekbare polymeren, zoals poly-L-lactide hebben aangetoond veel belofte in de dierproeven en de eerste klinische proeven, maar werden uiteindelijk herinnerd toen de “real-life” klinisch gebruik aangetoond hun minderwaardigheid aan de3e generatie DES8. Daarom is er een noodzaak om de biocompatibiliteit van bare metal stents te verbeteren voor betere patiëntresultaten.
CD47 is een alomtegenwoordig uitgedrukt transmembrane eiwit dat de aangeboren immuunrespons remt wanneer gebonden aan zijn cognate receptor Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9. De SIRPα-receptor heeft een itosineremmend motief (ITIM) en de signaleringsgebeurtenissen op SIRPα – CD47-interactie resulteert uiteindelijk in de downregulatie van ontstekingscelactivering10,11,12,13. Onderzoek in ons lab heeft aangetoond dat recombinant CD47 of zijn peptidederivaat, wat overeenkomt met het 22 aminozuur Ig-domein van het extracellulaire gebied van CD47 (pepCD47), de immuunrespons van de gastheer kan verminderen op een reeks klinisch relevante biomaterialen14,15,16. Onlangs hebben we aangetoond dat pepCD47 kan worden geïmmobiliseerd tot roestvrijstalen stentoppervlakken en de pathofysiologische respons die gepaard gaat met restenose aanzienlijk verminderen. Van belang, de pepCD47 gemodificeerde oppervlakken zijn vatbaar voor relevante gebruiksomstandigheden zoals langdurige opslag en ethyleenoxide sterilisatie17. Daartoe kan pepCD47 een nuttig therapeutisch doel zijn om de klinische beperkingen van endovasculaire stents aan te pakken.
De strategie voor de covalente bevestiging van pepCD47 aan een metalen oppervlak omvat een reeks nieuwe chemische modificaties van het metalen oppervlak. De metalen oppervlakken worden eerst bekleed met polyallylamine bisfosfonaat met latente thiolgroepen (PABT), gevolgd door de deprotectie van de thiolen en de bevestiging van polyethyleenimine (PEI) met geïnstalleerde pyridyldithiogroepen (PDT). PDT-groepen PEI die niet zijn ingenomen in de reactie met onbeschermde PABT-thiolen worden vervolgens gereageerd met pepCD47 waarin thiolen in de terminale cysteïneresiduen zijn verwerkt, wat resulteert in binding van pepCD47 aan het metalen oppervlak via een disulfide-binding14,17,18. We gebruikten een fluorofofoër geconjugeerde pepCD47 (TAMRA-pepCD47) om de inputconcentratie van peptide te bepalen die resulteert in de maximale oppervlakteimmobilisatie van het peptide. Ten slotte evalueerden we de acute en chronische ontstekingsremmende capaciteit van de met pepCD47 gecoate metalen oppervlakken, ex vivo, met behulp van respectievelijk het Chandler-lusapparaat en monocytenbevestiging/macrofaagexpansietest.
Dit document biedt een systematisch protocol voor de bevestiging van thiolated peptiden aan het metalen oppervlak; het bepalen van de maximale immobilisatiedichtheid van het peptide; en het beoordelen van de ontstekingsremmende eigenschappen van gecoat metalen pepcD47-oppervlakken die zijn blootgesteld aan volbloed en geïsoleerde monocyten.
We demonstreren en beschrijven een relatief nieuwe chemische strategie om therapeutische peptidemoieties toe te brengen aan een roestvrijstalen oppervlak met het overkoepelende doel om de reactiviteit van het oppervlak te verminderen met ontstekingscellen in bloed. De hierin beschreven bisfosfonaatchemie omvat coördinerende bindingsvorming tussen de metaaloxiden en bisfosfonaatgroepen van PABT. De dikte van polybisfosfonaatmonolaag gevormd op het metalen oppervlak bedraagt niet meer dan 5 nm18, e…
The authors have nothing to disclose.
Protocol ontwikkeling en studies gepresenteerd in dit document werden ondersteund door NIH (NBIB) R01 financiering (# EB023921) aan IF en SJS, en NIH (NHLBI) R01 financiering (# HL137762) aan IF en RJL.
1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH – 7.5 |
4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
Src peptide | Bachem | 4092599 | |
Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |