הקלת הדם נישא תא מצורף שתלים מתכת באמצעות CD47 נגזר פפטיד אימוביליזציה
Summary
מוצג כאן פרוטוקול לציריפת פפטיד CD47 (pepCD47) סטנטים מתכת באמצעות כימיה פוליביספוספונט. פונקציונליזציה של סטנטים מתכת באמצעות pepCD47 מונע את ההחזקה וההפעלה של תאים דלקתיים ובכך לשפר את תאימות ביולוגית שלהם.
Abstract
הסיבוכים העיקריים הקשורים סטנטים מתכת חשופים סטנטים מבריחים סמים הם restenosis ב סטנט ופקקת סטנט מאוחר, בהתאמה. לכן, שיפור התוואת הביולוגית של סטנטים מתכת נשאר אתגר משמעותי. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר טכניקה חזקה של שינוי פני משטח מתכת על ידי פפטידים פעילים ביולוגית כדי להגביר את תאימות ביולוגית של דם יצירת קשר עם שתלים רפואיים, כולל סטנטים אנדווסקולריים. CD47 הוא סמן אימונולוגי ספציפי למינים של עצמי ויש לו תכונות אנטי דלקתיות. מחקרים הראו כי פפטיד חומצת אמינו 22 המתאים לתחום Ig של CD47 באזור חוץ תאי (pepCD47), יש תכונות אנטי דלקתיות כמו חלבון באורך מלא. במחקרי vivo בחולדות, ובדיקות ויוו לשעבר במערכות ניסוי ארנב ודם אנושי מהמעבדה שלנו הראו כי pepCD47 immobilization על מתכות משפר את תאימות ביולוגית שלהם על ידי מניעת חיבור והפעלה של תאים דלקתיים. נייר זה מתאר את פרוטוקול שלב אחר שלב עבור פונקציונליזציה של משטחי מתכת וקובץ מצורף פפטיד. משטחי מתכת משתנים באמצעות ביספוספט פוליאלילמין עם קבוצות תיול סמוי (PABT) ואחריו פירוק של thiols והגדלה של אתרים תגובתיים תיול באמצעות תגובה עם פוליאתילן מותקן עם קבוצות pyridyldithio (PEI-PDT). לבסוף, pepCD47, שילוב שאריות ציסטאין מסוף המחוברים לרצף פפטיד הליבה באמצעות כפול 8-אמינו-3,6-dioxa-אוקטנויל spacer, מחוברים על פני המתכת באמצעות איגרות חוב disulfide. מתודולוגיה זו של חיבור פפטיד למשטח מתכת היא יעילה וזולת יחסית ולכן ניתן ליישם כדי לשפר את התואם הביולוגי של מספר חומרים ביולוגיים מתכתיים.
Introduction
התערבות כלילית מרדנית היא הקו הראשון של טיפול לטיפול במחלות עורקים כליליים (CAD) וכרוכה בעיקר בסטינג העורקים החולים. עם זאת, restenosis in-סטנט (ISR) ופקקת סטנט הם סיבוכים נפוצים הקשורים פריסת סטנט1. אינטראקציית דם בממשק סטנט הדם מאופיינת בהספיגה כמעט מיידית של חלבוני פלזמה על פני המתכת, ואחריו טסיות דם וחיבור תאי דלקתיותוהפעלה 2. שחרורו של ציטוקינות דלקתיות ו chemokines מתאי דלקתיים מופעלים מוביל לשינוי פנוטיפי של תאי שריר חלק כלי דם (VSMCs) בתקשורת tunica ומפעיל הנדידה הצנטריפטלית שלהם לתא אינטימי. התפשטות VSMC מופעל בתוצאות intima עיבוי שכבה אינטימית, לומן צמצום ו restenosis in-סטנט3. סטנטים לתרופה (DES) פותחו כדי למנוע התפשטות VSMC; עם זאת, תרופות אלה יש השפעה ציטוקסית מחוץ ליעד על תאי אנדותל4,,5. לכן, פקקת סטנט מאוחר הוא סיבוך נפוץ המשויך DES6,7. סטנטים עשויים פולימרים מתכלים, כגון poly-L-lactide הראו הבטחה רבה בניסויים בבעלי חיים וניסויים קליניים ראשוניים, אבל נזכרו בסופו של דבר כאשר השימוש הקליני “בחיים האמיתיים” הפגין נחיתותם 3rd דור DES8. לכן, יש צורך לשפר את התוואת הביולוגית של סטנטים מתכת חשופים לתוצאות טובות יותר של המטופל.
CD47 הוא חלבון transmembrane מבוטא בכל מקום המעכב את התגובה החיסונית המולדת כאשר קשור קולטן הקוניט שלה אות רגולציה חלבון אלפא (SIRPα)9. קולטן SIRPα יש תא חיסוני מעכב טירוסין מוטיב (ITIM) תחום ואת אירועי איתות על SIRPα – אינטראקציה CD47 בסופו של דבר לגרום ל downregulation של הפעלת תאים דלקתיים10,,11,,12,,13. מחקרים במעבדה שלנו הראו כי CD47 רקומביננטי או נגזרת פפטיד שלה, המקביל 22 חומצת אמינו איג תחום של האזור החוץ תאי של CD47 (pepCD47), יכול להפחית את התגובה החיסונית המארח למגוון של חומרים ביולוגייםרלוונטיים קלינית 14,15,,16. לאחרונה, הוכחנו כי pepCD47 יכול להיות משותק למשטחי סטנט נירוסטה ולהפחית באופן משמעותי את התגובה הפתופיזיולוגית הקשורים restenosis. שים לב, pepCD47 משטחים שונה הם מותאים לתנאי שימוש רלוונטיים כגון אחסון לטווח ארוך ועיקור תחמוצת אתילן17. כתוצאה מכך, pepCD47 עשוי להיות יעד טיפולי שימושי כדי לטפל במגבלות הקליניות של סטנטים אנדווסקולריים.
האסטרטגיה עבור ההחזקה הקוולנטית של pepCD47 למשטח מתכת כרוכה בסדרה של שינויים כימיים חדשניים של פני המתכת. משטחי מתכת מצופים תחילה ביספוספונט פוליאלילמין עם קבוצות thiol סמוי (PABT) ואחריו פירוק של thiols וחיבור של פוליאתילן (PEI) עם קבוצות פיריילדיתיו מותקן (PDT). קבוצות PDT של PEI לא קוסם בתגובה עם thiols PABT לא מוגן לאחר מכן מגיבים עם pepCD47 שילוב תיול במסוף שאריות ציסטאין, וכתוצאה מכך pepCD47 מחייב על פני משטח המתכת באמצעות אג”ח disulfide14,17,18. השתמשנו pepCD47 פלואורופור התואם (TAMRA-pepCD47) כדי לקבוע את ריכוז הקלט של פפטיד שתוצאות אי-תנועה המרבית של פני השטח של פפטיד. לבסוף, הערכנו את הקיבולת האנטי דלקתית חריפה וכרונית של משטחי מתכת מצופים pepCD47, ex vivo, באמצעות חלונית לולאה צ’נדלר, וחיבור מונוציט / התרחבות מקרופאג’, בהתאמה.
נייר זה מספק פרוטוקול שיטתי לחיבור פפטידים thiolated על פני משטח המתכת; קביעת צפיפות ההשתקה המרבית של הפפטיד; והערכת המאפיינים האנטי דלקתיים של משטחי מתכת מצופים pepCD47 חשופים לדם שלם ומונוציטים מבודדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מדגימים ומתארים אסטרטגיה כימית חדשנית יחסית לצרף moieties פפטיד טיפולית על משטח נירוסטה במטרה overarching של הפחתת תגובתיות פני השטח עם תאים דלקתיים נמצאו בדם. הכימיה ביספוספונט המתואר בזאת כרוך תיאום היווצרות קשר בין תחמוצות מתכת וקבוצות ביספוספונט של PABT. העובי של מונושכבה פוליביספונט נוצר ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פיתוח פרוטוקולים מחקרים שהוצגו בנייר זה נתמכו על ידי מימון NIH (NBIB) R01 (# EB023921) ל- IF ו- SJS, ומימון NIH (NHLBI) R01 (# HL137762) ל- IF ו- RJL.
Materials
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH – 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
Riferimenti
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, 392584 (2013).
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of ‘marker of self’ CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
