CD47-व्युत्पन्न पेप्टाइड इम्मोबिलाइजेशन के माध्यम से धातु प्रत्यारोपण के लिए रक्त जनित कोशिका लगाव का शमन
Summary
यहां प्रस्तुत पॉलीबिस्फोस्फोनेट रसायन का उपयोग करके धातु स्टेंट के लिए पेप्टाइड सीडी 47 (pepCD47) के लिए एक प्रोटोकॉल है। pepCD47 का उपयोग करके धातु स्टेंट का कार्यात्मककरण भड़काऊ कोशिकाओं के लगाव और सक्रियण को रोकता है जिससे उनकी जैव अनुकूलता में सुधार होता है।
Abstract
नंगे धातु स्टेंट और दवा eluting स्टेंट के साथ जुड़े प्रमुख जटिलताओं में स्टेंट रेस्टेनोसिस और देर से स्टेंट थ्रोम्बोसिस, क्रमशः कर रहे हैं । इस प्रकार, धातु स्टेंट की जैव अनुकूलता में सुधार एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एंडोवैस्कुलर स्टेंट सहित रक्त संपर्क चिकित्सा प्रत्यारोपण की जैव अनुकूलता बढ़ाने के लिए जैविक रूप से सक्रिय पेप्टाइड्स द्वारा धातु सतह संशोधन की एक मजबूत तकनीक का वर्णन करना है। CD47 एक इम्यूनोलॉजिकल प्रजाति-स्वयं का विशिष्ट मार्कर है और इसमें विरोधी भड़काऊ गुण हैं। अध्ययनों से पता चला है कि एक्सट्रासेलुलर क्षेत्र (pepCD47) में सीडी 47 के आईजी डोमेन के अनुरूप 22 अमीनो एसिड पेप्टाइड में पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन जैसे एंटी-भड़काऊ गुण होते हैं। चूहों में वीवो अध्ययन में, और हमारी प्रयोगशाला से खरगोश और मानव रक्त प्रयोगात्मक प्रणालियों में पूर्व वीवो अध्ययनों ने दिखा दिया है कि धातुओं पर pepCD47 स्थिरीकरण भड़काऊ कोशिका लगाव और सक्रियण को रोककर उनकी जैव अनुकूलता में सुधार करता है। यह पेपर धातु की सतहों और पेप्टाइड लगाव के कार्यात्मकीकरण के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। धातु की सतहों को अव्यक्त थिओल समूहों (पीएबीटी) के साथ पॉलीडालैमिन बिस्फोस्फेट का उपयोग करके संशोधित किया जाता है जिसके बाद थिओलों का संरक्षण होता है और पाइरिडिलिडिओ समूहों (पीई-पीडीटी) के साथ स्थापित पॉलीथीलेनिमाइन के साथ प्रतिक्रिया के माध्यम से थिओल-प्रतिक्रियाशील साइटों का प्रवर्धन होता है। अंत में, pepCD47, एक दोहरी 8-अमीनो-3, 6-डायोक्सा-ऑक्टानोइल स्पेसर के माध्यम से कोर पेप्टाइड अनुक्रम से जुड़े टर्मिनल सिस्टीन अवशेषों को शामिल करते हुए, डिसल्फाइड बांड के माध्यम से धातु की सतह से जुड़े होते हैं। धातु की सतह के लिए पेप्टाइड लगाव की यह पद्धति कुशल और अपेक्षाकृत सस्ती है और इस प्रकार कई धातु बायोमैटेरियल्स की जैव अनुकूलता में सुधार करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
परक्यूटेनियस कोरोनरी हस्तक्षेप कोरोनरी धमनी रोगों (सीएडी) के इलाज के लिए चिकित्सा की पहली पंक्ति है और मुख्य रूप से रोगग्रस्त धमनियों को स्टेंटिंग करना शामिल है। हालांकि, इन-स्टेंट रेस्टेनोसिस (आईएसआर) और स्टेंट थ्रोम्बोसिस स्टेंट तैनाती से जुड़ी आम जटिलताएं हैं1। रक्त-स्टेंट इंटरफ़ेस में रक्त संपर्क धातु की सतह पर प्लाज्मा प्रोटीन के लगभग तत्काल सोखने की विशेषता है, जिसके बाद प्लेटलेट और भड़काऊ सेल लगाव और सक्रियण2है। सक्रिय भड़काऊ कोशिकाओं से भड़काऊ साइटोकिन्स और केमोकिन्स की रिहाई ट्यूनिका मीडिया में संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (वीएसएमसी) के फेनोटाइपिक संशोधन की ओर जाता है और उनके केंद्रीय प्रवास को इंटिमल डिब्बे में चलाता है। इंटिमा में सक्रिय वीएसएमसी के प्रसार के परिणामस्वरूप इंटिमल परत मोटा होता है, ल्यूमेन संकुचन और इन-स्टेंट रेस्टेनोसिस3 होताहै। वीएसएमसी प्रसार को रोकने के लिए ड्रग एल्यूटिंग स्टेंट (डीईएस) विकसित किए गए थे; हालांकि, इन दवाओं एंडोथेलियल सेल्स4,5पर एक ऑफ टारगेट साइटोटॉक्सिक प्रभाव है . इसलिए, लेट स्टेंट थ्रोम्बोसिस डेस6,7से जुड़ी एक आम जटिलता है । पॉली-एल-लैक्डाइड जैसे बायोडिग्रेडेबल पॉलिमर से बने स्टेंट ने पशु प्रयोगों और प्रारंभिक नैदानिक परीक्षणों में बहुत वादा दिखाया है, लेकिन अंततः याद किया गया जब “वास्तविक जीवन” नैदानिक उपयोग ने 3पीढ़ी डेस8के लिए अपनी हीनता का प्रदर्शन किया। इसलिए, बेहतर रोगी परिणामों के लिए नंगे धातु स्टेंट की जैव अनुकूलता में सुधार करने की आवश्यकता है।
CD47 एक सर्वव्यापी रूप से व्यक्त ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन है जो अपने कॉग्नेट रिसेप्टर सिग्नल रेगुलेटरी प्रोटीन अल्फा (SIRPα)9से बंधे होने पर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को रोकता है। सिरपीपी रिसेप्टर में एक प्रतिरक्षा कोशिका टायरोसिन निरोधात्मक आकृति (आईटीआईएम) डोमेन होता है और सिरपी-सीडी 47 इंटरैक्शन पर सिग्नलिंग घटनाओं के परिणामस्वरूप अंततः भड़काऊ कोशिका सक्रियण10 , 11,,12,,13की कमी होती है ।13 हमारी प्रयोगशाला में अनुसंधान से पता चला है कि सीडी 47 (pepCD47) के बाह्रात्म क्षेत्र के 22 अमीनो एसिड आईजी डोमेन के अनुरूप, पुनः संयोजन सीडी 47 या इसके पेप्टाइड डेरिवेटिव, चिकित्सकीय प्रासंगिक बायोमैटेरियल्स14,15, 16,16की एक श्रृंखला के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कम कर सकते हैं।, हाल ही में, हमने दिखा दिया है कि pepCD47 को स्टेनलेस स्टील स्टेंट सतहों पर स्थिर किया जा सकता है और रेस्टेनोसिस से जुड़े रोगविज्ञानी प्रतिक्रिया को काफी कम किया जा सकता है। ध्यान दें, pepCD47 संशोधित सतहों दीर्घकालिक भंडारण और एथिलीन ऑक्साइड नसबंदी17के रूप में प्रासंगिक उपयोग की स्थिति के लिए उत्तरदायी हैं । इस उद्देश्य के लिए, pepCD47 एंडोवैस्कुलर स्टेंट की नैदानिक सीमाओं को संबोधित करने के लिए एक उपयोगी चिकित्सीय लक्ष्य हो सकता है।
एक धातु की सतह के लिए pepCD47 के सहसंयोजक लगाव के लिए रणनीति धातु की सतह के उपंयास रासायनिक संशोधनों की एक श्रृंखला शामिल है । धातु की सतहों को पहले अव्यक्त थिओल समूहों (पीएबीटी) के साथ पॉलीलैमीन बिस्फोस्फोनेट के साथ लेपित किया जाता है और इसके बाद थिओलों की सुरक्षा और स्थापित पाइरिडिलिडिओ समूहों (पीडीटी) के साथ पॉलीथीलीनिमाइन (पीईआई) का लगाव होता है। डीप्रोटेक्टेड PABT थिओल्स के साथ प्रतिक्रिया में समाप्त पीडीटी समूहों को तब पेप्टडी 47 के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की जाती है, जिसमें टर्मिनल सिस्टीन अवशेषों में थिओल शामिल होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप पेप्सडी 47 को एक डिफाइड बॉन्ड14,17, 18,के माध्यम से धातु की सतह पर बाध्यकारी कियाजाताहै।, हमने पेप्टाइड की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक फ्लोरोफोर संयुग्मित pepCD47 (TAMRA-pepCD47) का उपयोग किया जिसके परिणामस्वरूप पेप्टाइड की अधिकतम सतह स्थिरीकरण होता है। अंत में, हमने क्रमशः चांडलर लूप उपकरण, और मोनोसाइट अटैचमेंट/मैक्रोफेज विस्तार परख का उपयोग करके pepCD47 लेपित धातु सतहों, पूर्व वीवो की तीव्र और पुरानी विरोधी भड़काऊ क्षमता का मूल्यांकन किया ।
यह पेपर धातु की सतह पर थिओलेटेड पेप्टाइड्स के लगाव के लिए एक व्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रदान करता है; पेप्टाइड के अधिकतम स्थिरीकरण घनत्व का निर्धारण; और pepCD47 लेपित धातु सतहों के विरोधी भड़काऊ गुणों का आकलन पूरे रक्त और अलग मोनोसाइट्स के संपर्क में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम रक्त में पाई जाने वाली भड़काऊ कोशिकाओं के साथ सतह की प्रतिक्रियाशीलता को कम करने के व्यापक लक्ष्य के साथ एक स्टेनलेस-स्टील सतह पर चिकित्सीय पेप्टाइड मोइटीज को संलग्न करने के लिए एक अपेक्षाकृत उपन्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल विकास और अध्ययनों को एनआईएच (NBIB) R01 फंडिंग (# EB023921) द्वारा आईएफ और एसजेएस को समर्थन दिया गया था, और एनआईएच (NHLBI) R01 फंडिंग (#HL137762) को आईएफ और आरजेएल को ।
Materials
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH – 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
Riferimenti
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