Смягчение присоединения клеток крови к металлическим имплантатам с помощью CD47-выведенной пептидной иммобилизации
Summary
Здесь представлен протокол для применения пептида CD47 (pepCD47) к металлическим стентам с использованием химии полибисфосфоната. Функционализация металлических стентов с использованием pepCD47 предотвращает вложение и активацию воспалительных клеток, улучшая тем самым их биосовместимость.
Abstract
Ключевыми осложнениями, связанными с голыми металлическими стентами и противоопухоленными стентами, являются стент-ретеноз и тромбоз позднего стента, соответственно. Таким образом, улучшение биосовместимости металлических стентов остается важной проблемой. Целью этого протокола является описание надежной техники модификации поверхности металла биологически активными пептидами для повышения биосовместимости контактных с кровью медицинских имплантатов, включая эндоваскулярные стенты. CD47 является иммунологическим видом-специфическим маркером себя и имеет противовоспалительные свойства. Исследования показали, что 22 аминокислотный пептид, соответствующий домену Ig CD47 во внеклеточной области (pepCD47), имеет противовоспалительные свойства, такие как белок в полный рост. Исследования In vivo на крысах и исследования ex vivo в экспериментальных системах крови кролика и человека из нашей лаборатории показали, что иммобилизация pepCD47 на металлы улучшает их биосовместимость, предотвращая воспалительную клеточную привязанность и активацию. В этом документе описывается пошаговая протокола для функционализации металлических поверхностей и пептидного крепления. Металлические поверхности модифицируются с использованием полиаллиламин бисфосфата с скрытыми группами тиола (PABT), а затем депротекторции тиолов и усиления тиол-реактивных сайтов через реакцию с полиэтиленемин установлен с пиридилдитио групп (PEI-PDT). Наконец, pepCD47, включающий остатки терминального цистея, подключенные к последовательности пептида ядра через двойной 8-амино-3,6-диокса-октанойловый промеец, прикрепляются к металлической поверхности через дисульфидные связи. Эта методология пептидного крепления к металлической поверхности эффективна и относительно недорога и, таким образом, может быть применена для улучшения биосовместимости нескольких металлических биоматериалов.
Introduction
Перкутанное коронарное вмешательство является первой линией терапии для лечения ишемической болезни сердца (КАД) и в первую очередь включает стентирование больных артерий. Тем не менее, стент рестиденоз (ISR) и тромбоз стента являются общими осложнениями, связанными с стентом развертывания1. Взаимодействие крови в интерфейсе кровеутного стента характеризуется почти немедленной асорпцией плазменных белков на металлической поверхности, за которой следуют тромбоциты и воспалительные клеточныевложения и активация 2. Высвобождение воспалительных цитокинов и хемокиных из активированных воспалительных клеток приводит к фенотипической модификации сосудистых гладких мышечных клеток (ВКС) в туниках и вызывает их центропротезную миграцию в интимальный отсек. Пролиферация активированного VSMC в интиме приводит к утолщению интимального слоя, сужению люмена и стентному реренозу3. Для предотвращения распространения VSMC были разработаны противомедикаментозные стенты (DES); однако, эти препараты имеют внецелевое цитотоксическое воздействие на эндотелиальныеклетки 4,,5. Таким образом, поздний тромбоз стента является распространенным осложнением, связанным с DES6,7. Стенты из биоразлагаемых полимеров, таких как поли-L-лактид показали много перспектив в экспериментах на животных и первоначальных клинических испытаний, но в конечномитогенапомнил, когда “реальной жизни” клиническое использование продемонстрировали свою неполноценность 3-го поколения DES 8 .rd Таким образом, необходимо улучшить биосовместимость голых металлических стентов для улучшения исходов пациентов.
CD47 является повсеместно выраженным трансмембранным белком, который подавляет врожденный иммунный ответ, когда связан с его конгнатным рецептором Signal Regulatory Protein alpha (SIRP)9. Рецептор SIRP имеет иммунную клетку ингибиторный мотив (ITIM) домена и сигнальных событий на SIRP – CD47 взаимодействия в конечном итоге привести к downregulation воспалительнойактивации клеток 10,11,12,13. Исследования в нашей лаборатории показали, что рекомбинантный CD47 или его пептидная производная, соответствующая 22 аминокислота Ig домен внеклеточной области CD47 (pepCD47), может уменьшить иммунный ответ хозяина на ряд клиническизначимых биоматериалов 14,15,16. Недавно мы продемонстрировали, что pepCD47 может быть обездвижен до стентных поверхностей из нержавеющей стали и значительно уменьшить патофизиологическую реакцию, связанную с ретенозом. Следует отметить, что модифицированные поверхности pepCD47 подложки для соответствующих условий использования, таких как долгосрочное хранение и стерилизацияоксида этилена 17. С этой целью pepCD47 может быть полезной терапевтической мишенью для устранения клинических ограничений эндоваскулярных стентов.
Стратегия ковалентного крепления pepCD47 к металлической поверхности включает в себя ряд новых химических модификаций металлической поверхности. Металлические поверхности сначала покрыты полиаллиламин бисфосфонатом с скрытыми группами тиола (PABT), а затем депротекторцией тиол и креплением полиэтилена (PEI) с установленными группами пиридилдиотио (PDT). PDT групп PEI unconsumed в реакции с deprotected PABT тиолы затем реагировали с pepCD47 включения тиолов в терминале остатков цистеин, в результате чего связывание pepCD47 к металлической поверхности черездисульфид связи 14,17,18. Мы использовали флюорофор конъюгированный pepCD47 (TAMRA-pepCD47) для определения входной концентрации пептида, что приводит к максимальной иммобилизации поверхности пептида. Наконец, мы оценили острую и хроническую противовоспалительную способность металлических поверхностей с покрытием pepCD47, ex vivo, используя аппарат петли Чендлера, и анализ расширения моноцитов/макрофагов, соответственно.
В настоящем документе содержится систематический протокол крепления изолированных пептидов к металлической поверхности; определение максимальной плотности иммобилизации пептида; и оценки противовоспалительных свойств металлических поверхностей с покрытием pepCD47, подверженных воздействию всей крови и изолированных моноцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы демонстрируем и описываем относительно новую химическую стратегию для применения терапевтических пептидных moieties к поверхности из нержавеющей стали с общей целью снижения реактивности поверхности с воспалительными клетками, найденными в крови. Химия бисфосфоната, описанная в это?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Разработка протокола и исследования, представленные в настоящем документе, были поддержаны финансированием NIH (NBIB) R01 (является EB023921) ИФ и SJS, а также финансированием R01 (NHLBI) (No HL137762) ДЛЯ и RJL.
Materials
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH – 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
Riferimenti
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, 392584 (2013).
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of ‘marker of self’ CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
