Lindring av blodburna cellen bilaga till metallimplantat genom CD47-derived Peptide Immobilization
Summary
Presenteras här är ett protokoll för appending peptid CD47 (pepCD47) till metall stent med hjälp av polybisfosfonat kemi. Funktionalisering av metallstent med hjälp av pepCD47 förhindrar fastsättning och aktivering av inflammatoriska celler därmed förbättra deras biokompatibilitet.
Abstract
De viktigaste komplikationerna som är associerade med bare metal stent och drog elusing stents är i-stent restenosis och sen stent blodpropp, respektive. Således är förbättring av biokompatibiliteten för metallstent fortfarande en betydande utmaning. Målet med detta protokoll är att beskriva en robust teknik för metall ytmodifiering av biologiskt aktiva peptider för att öka biokompatibiliteten hos blod som kontaktar medicinska implantat, inklusive endovaskulära stent. CD47 är en immunologisk artspecifik markör för själv och har antiinflammatoriska egenskaper. Studier har visat att en 22 aminosyra peptid som motsvarar Ig domän av CD47 i extracellulära regionen (pepCD47), har antiinflammatoriska egenskaper som den fullängds protein. In vivo studier på råttor, och ex vivo studier i kanin och mänskliga blod experimentella system från vårt labb har visat att pepCD47 immobilisering på metaller förbättrar deras biokompatibilitet genom att förhindra inflammatoriska cell fastsättning och aktivering. Detta papper beskriver steg-för-steg-protokollet för funktionalisering av metallytor och peptidtillsats. Metallytorna modifieras med hjälp av polyallaminbisfosfat med latent tiolgrupper (PABT) följt av deprotection av tioler och förstärkning av tioolreaktiva ställen via reaktion med polyetenylenimin installerad med pyridyldithio-grupper (PEI-PDT). Slutligen, pepCD47, som innehåller terminal cystein rester ansluten till kärnan peptidsekvens genom en dubbel 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl spacer, är knutna till metallytan via disulfid obligationer. Denna metodik av peptid fastsättning till metallyta är effektiv och relativt billig och kan därmed tillämpas för att förbättra biokompatibiliteten hos flera metalliska biomaterial.
Introduction
Perkutan koronar intervention är den första raden av terapi för att behandla kranskärlssjukdomar (CAD) och i första hand innebär stenting de sjuka artärerna. Däremot är in-stent restenosis (ISR) och stent trombos vanliga komplikationer i samband med stent utplacering1. Blodinteraktion vid blod-stent-gränssnittet kännetecknas av en nästan omedelbar adsorption av plasmaproteiner på metallyta, följt av trombocyt och inflammatorisk celltillsats ochaktivering 2. Frisättningen av de inflammatoriska cytokinerna och kemokineerna från aktiverade inflammatoriska celler leder till den fenotypiska modifieringen av de vaskulära glattmuskelcellerna (VSMCs) i tunicamedierna och utlöser deras centrilamalmigration till intimalfacket. Spridning av aktiverad VSMC i intimiteten resulterar i intimalskikt förtjockning, lumen förträngning och i-stent restenosis3. Drug eluing stents (DES) utvecklades för att förhindra VSMC spridning; dessa läkemedel har dock en cytotoxisk effekt utanför målgruppen på de endotelceller4,5. Därför är sen stenttrombos en vanlig komplikation som är associerad med DES6,7. Stent av biologiskt nedbrytbara polymerer, såsom poly-L-laktid har visat mycket lovande i djurförsök och inledande kliniska prövningar, men så småningom återkallades när “verkliga” kliniska användningen visat sin underlägsenhet till 3rd generation DES8. Därför finns det ett behov av att förbättra biokompatibiliteten hos nakna metallstent för bättre patientresultat.
CD47 är ett allestädes närvarande uttryckt transmembran protein som hämmar det medfödda immunsvaret när det är bundet till dess kongnatre receptor Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9. SIRPα-receptorn har en immuncellstyrosinhämmande motiv (ITIM) domän och signalhändelserna vid SIRPα – CD47-interaktionen resulterar i slutändan i nedreglering av inflammatoriskcellaktivering 10,11,12,13. Forskning i vårt labb har visat att rekombinanta CD47 eller dess peptidderivat, motsvarande 22 aminosyra Ig domän av extracellulära regionen CD47 (pepCD47), kan minska värd immunsvaret till en rad kliniskt relevanta biomaterial14,15,16. Nyligen har vi visat att pepCD47 kan immobiliseras till rostfritt stål stent ytor och avsevärt minska det patofysiologiska svaret i samband med restenosis. Att notera, de pepCD47 modifierade ytorna är mottagliga för relevanta användningsförhållanden såsom långtidslagring och etylenoxidsterilisering17. För detta ändamål kan pepCD47 vara ett användbart terapeutiskt mål att ta itu med de kliniska begränsningarna av endovaskulära stent.
Strategin för kovalent fastsättning av pepCD47 till en metallyta innebär en serie nya kemiska modifieringar av metallytan. Metalytorna belagda först med polyallaminbisfosfonat med latent tiolsgrupper (PABT) följt av deprotection av tiolerorna och fastsättning av polyetenimin (PEI) med installerade pyridyldithiogrupper (PDT). PDT grupper av PEI unconsumed i reaktionen med deprotected PABT tioler sedan reageras med pepCD47 införliva thiols i terminalen cystein rester, vilket resulterar i bindande pepCD47 till metallytan via en disulfid bond14,17,18. Vi använde en fluorophore konjugerad pepCD47 (TAMRA-pepCD47) för att bestämma ingångskoncentrationen av peptid som resulterar i den maximala ytan immobilisering av peptiden. Slutligen utvärderade vi den akuta och kroniska antiinflammatoriska kapaciteten hos pepCD47 belagda metallytor, ex vivo, med hjälp av Chandler loop apparaten och monocyt fastsättning/makrofag expansion assay, respektive.
Detta papper ger ett systematiskt protokoll för fastsättning av tiolerat peptider till metallyta; bestämmande av peptidens maximala immobiliseringsdensitet; och bedöma de antiinflammatoriska egenskaperna hos pepCD47 belagda metallytor som utsätts för helblod och isolerade monocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi demonstrerar och beskriver en relativt ny kemisk strategi för att lägga till terapeutisk peptid moieties till en rostfri yta med det övergripande målet att minska ytans reaktivitet med inflammatoriska celler som finns i blodet. Bisfosfonatkemin som beskrivs häri innebär att man koordinerar bindningsbildning mellan metalloxiderna och bisfosfonatgrupperna av PABT. Tjockleken på polybisfosfonat monolayer bildas på metallyta inte överstiger 5 nm18, och, därför, är oviktiga för de poten…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Protokollutveckling och studier som presenterades i detta dokument stöddes av NIH (NBIB) R01 finansiering (# EB023921) till IF och SJS, och NIH (NHLBI) R01 finansiering (# HL137762) till IF och RJL.
Materials
| 1 M Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | pH – 7.5 |
| 4% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16539-07 | |
| 4% Sodium Citrate | Sigma | S5770 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals | 118-156-721 | |
| anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 202301 | |
| anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19) | Biolegend | 203501 | |
| anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52) | BD Biosciences | 550979 | |
| anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1) | BioRad | MCA341 | |
| anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8) | Biolegend | 201701 | |
| Chloroform Certified ACS | Fisher Chemical | C298-500 | |
| Dimethyl Formammide (DMF) | Alfa Aesar | 39117 | |
| Embra stainless steel grid | Electron Microscopy Sciences | E200-SS | stainless steel mesh mesh disks |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Glacial acetic acid | ACROS organic | 148930025 | |
| goat anti-mouse IgG Alexa Fluor | ThermoFisher | A11030 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceuticals | 402-01 | |
| Human pepCD47 | Bachem | 4099101 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A426P-4 | |
| Metal adapters | Leur Fitting | 6515IND | 1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end |
| Methanol | RICCA chemical company | 4829-32 | |
| Microscope | Nikon Eclipse | TE300 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | |
| Pottasium Bicarbonate (KHCO3) | Fisher Chemical | P184-500 | |
| PVC tubes | Terumo-CVS | 60050 | 1/4" X 1/16 8' |
| sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | 11653 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad laboratories | 161-0302 | |
| Sodum actetate (C2H3NaO2) | Alfa Aesar | A13184 | |
| Src peptide | Bachem | 4092599 | |
| Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen | Microgroup, Medway, MA | 20097328 | 1 cm X 6 mm OD |
| Stainless steel foils (AISI 316L) | Goodfellow, Coraopolis, PA | 100 mm X 100 mm X 0.05 mm | |
| Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47) | Bachem | 4100277 | |
| TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Thermo Scientific | PG82089 | |
| Tween-20 | Bio-Rad laboratories | 170-6531 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Invitrogen | V12883 |
Riferimenti
- Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, 392584 (2013).
- Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
- Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
- Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
- Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
- Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
- Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
- Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
- Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of ‘marker of self’ CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
- Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
- Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
- Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
- Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
- vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
- Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
