小鼠肾-居民CD8+T 细胞的分离，用于流细胞测量分析
Summary
病毒感染后，肾脏含有相对大量的CD8+T 细胞，并提供一个机会来研究非粘膜TRM 细胞。在这里，我们描述了一个方案，分离小鼠肾淋巴细胞流动细胞学分析。
Abstract
组织驻留记忆T细胞（TRM）是免疫学研究领域的一个迅速扩展的领域。将T细胞从各种非淋巴组织中隔离是研究T RM s的关键步骤之一。不同器官的淋巴细胞分离方案有轻微的变异。肾脏是一种重要的非淋巴器官，具有许多免疫细胞渗透，尤其是在病原体暴露或自身免疫激活之后。近年来，包括我们自己的实验室已经开始在小鼠和人类的各种生理和病理环境中对肾脏居民CD8+T 细胞进行特征化。由于T淋巴细胞的丰富，肾脏是一个有吸引力的模型器官，研究TRM在非粘膜或非屏障组织。在这里，我们将描述一个协议，常用在TRM为重点的实验室，以分离CD8+T 细胞从小鼠肾脏后，全身病毒感染。简单地说，在C57BL/6小鼠中，使用急性淋巴细胞性胆囊炎病毒（LCMV）感染模型，我们演示血管内CD8+T 细胞标记、酶消化和密度梯度离心，以分离和丰富小鼠肾脏中的淋巴细胞，使样本为随后的流动囊细胞分析做好准备。
Introduction
组织居民记忆 （TRM） T 细胞是成年人类和受感染小鼠中最丰富的 T 细胞群之一.TRM细胞提供免疫防御的第一线，并严重参与各种生理和病理过程1，2，3，4，5。与循环T细胞相比，TRM细胞携带独特的表面标记与独特的转录程序6，7，8。扩大我们对TRM生物学的了解是了解T细胞反应的关键，而T细胞反应对于T细胞疫苗和免疫疗法的未来发展至关重要。
除了在所有非淋巴组织中共同共享的TRM分子标记外，积累的证据表明，组织特异性特征是TRM 生物学9的核心成分。肾脏在感染后含有许多免疫细胞，包括TRM 细胞，为研究非粘膜组织中TRM 细胞生物学提供了绝佳的机会。急性LCMV（淋巴细胞性胆囊炎病毒）通过内皮内途径感染是研究小鼠抗原特异性T细胞反应的成熟系统感染模型。感染通常在野生型小鼠的7-10天内解决，并在各种组织中留下大量的LCMV特异性记忆T细胞，包括肾脏10。P14 TCR（T细胞受体）转基因小鼠携带CD8+T 细胞，可识别由MHC-I（I类主要组织相容性复合物）分子H2-D b在C57BL/6小鼠 中呈现的LCMV免疫显性表一。结合在小鼠中结合标记的P14 T细胞收养转移和LCMV感染，CD8+效应 和记忆T细胞被跟踪，包括TRM 分化和平衡。
在某些屏障组织中，如肠道内腹淋巴细胞（IEL）隔间和唾液腺，建立的淋巴细胞分离程序产生高百分比的TRM细胞 与最小的血性T细胞污染在小鼠LCMV模型11。然而，在非屏障组织中，如肾脏，密集的血管网络中含有大量的循环CD8+T 细胞。有据可查，即使成功灌注也不能有效去除所有循环的CD8+T 细胞。为了克服这一技术障碍，血管内抗体染色已确立为T RM实验室12中最常用的 技术之一。简言之，在安乐死前3-5分钟，静脉注射3微克/小鼠抗CD8抗体（给CD8+T 细胞贴标签）。完整的血管壁可防止抗体在如此短的时间内（即3-5分钟）快速扩散，并且只有血管内细胞被标记。按照标准的淋巴细胞分离方案，血管内细胞与血管外细胞可以很容易地区分使用流细胞学。
在这里，我们将描述一个标准协议，常用在TRM 实验室执行血管内标签，淋巴细胞分离和流动细胞分析肾脏CD8+ T细胞使用C57BL/6小鼠，已收到CD45.1+ P14 T细胞和LCMV感染30天前13。相同的协议可用于研究肾脏中的效应器和记忆T细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于组织特异性免疫是一个快速扩展的研究领域，积累证据表明，免疫细胞，特别是淋巴细胞种群可以在成人人类或受感染或免疫小鼠的几乎所有器官中识别。LCMV小鼠感染模型是研究抗原特异性T细胞反应、效应和记忆T细胞分化（包括TRM生物学在内的多个组织） 的成熟模型。在这里，我们描述了一个分析肾中的CD8+T 细胞的协议。该协议在很大程度上改编自以TRM<sup class="xre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIH赠款AI125701和AI139721，癌症研究所剪辑计划和美国癌症协会赠款RSG-18-222-01-LIB到N.Z的支持。我们感谢来自流细胞测量设施的卡拉·戈雷纳和塞巴斯蒂安·蒙塔尼诺。在流量细胞学共享资源设施中生成的数据得到位于圣安东尼奥的德克萨斯大学健康科学中心（UTHSCSA）、NIH/NCI赠款P30 CA054174-20（UTHSCSA的临床和转化研究中心[CTRC]）和UL1 TR001120（临床和转化科学奖）的支持。
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
Riferimenti
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