Isolering av mus nyre-resident CD8+ T celler for Flow Cytometry Analyse
Summary
Etter virusinfeksjon, nyre havner et relativt stort antall CD8+ T celler og tilbyr en mulighet til å studere ikke-slimhinne TRM celler. Her beskriver vi en protokoll for å isolere mus nyrelymfocytter for flytcytometrianalyse.
Abstract
Tissue-resident memory T celle (TRM) er et raskt voksende felt av immunologi forskning. Isolere T-celler fra ulike ikke-lymfoide vev er en av de viktigste trinnene for å undersøke TRMs. Det er små variasjoner i lymfocyttisolasjonsprotokoller for forskjellige organer. Nyre er et viktig ikke-lymfoid organ med mange immuncelleinfiltrasjon, spesielt etter patogeneksponering eller autoimmun aktivering. I de senere årene har flere laboratorier, inkludert våre egne, begynt å karakterisere nyrebosatte CD8+ T-celler i ulike fysiologiske og patologiske innstillinger i både mus og menneske. På grunn av overflod av T-lymfocytter representerer nyre et attraktivt modellorgan for å studere TRMs i ikke-slimhinne- eller ikke-barrierevev. Her vil vi beskrive en protokoll som vanligvis brukes i TRM-fokusertelaboratorier for å isolere CD8+ T-celler fra musenyre etter systemisk virusinfeksjon. Kort, ved hjelp av en akutt lymfatisk choriomeningitt virus (LCMV) infeksjon modell i C57BL/6 mus, viser vi intravaskulær CD8+ T celle merking, enzymatisk fordøyelse, og tetthet gradient sentrifugasjon for å isolere og berike lymfocytter fra mus nyrer for å gjøre prøver klar for den påfølgende flyt cytometri analyse.
Introduction
Tissue-resident minne (TRM) T celler representerer en av de mest tallrike T cellepopulasjoner i voksne mennesker og infiserte mus. TRM-celler gir den første linjen av immunforsvar og er kritisk involvert i ulike fysiologiske og patologiske prosesser1,2,3,4,5. Sammenligner med sirkulerende T-celler, TRM celler bære distinkte overflatemarkører med unike transkripsjonsprogrammer6,7,8. Å utvide vår kunnskap om TRM biologi er nøkkelen til å forstå T celleresponser som er avgjørende for fremtidig utvikling av T-cellebaserte vaksiner og immunterapier.
I tillegg til vanlige delte molekylære markører av TRMs på tvers av alle ikke-lymfoide vev, akkumulerende bevis tyder på at vev-spesifikke funksjoner er en sentral komponent i TRM biologi9. Nyre havner mange immunceller inkludert TRM celler etter infeksjon og gir en flott mulighet til å studere TRM cellebiologi i en ikke-slimhinnevev. Akutt LCMV (lymfatisk choriomeningittvirus) infeksjon via intraperitoneal rute er en veletablert systemisk infeksjonsmodell for å studere antigenspesifikke T-celleresponser hos mus. Infeksjonen er vanligvis løst i 7-10 dager i vill type mus og la et stort antall LCMV-spesifikke minne T-celler i en rekke vev, inkludert nyre10. P14 TCR (T cellereseptor) transgene mus bærer CD8+ T-celler gjenkjenner en av de immundominerende epitopene til LCMV presentert av MHC-I (klasse I store histokompatibilitetskompleks) molekyl H2-Db i C57BL/6 mus. Ved å kombinere congenically merket P14 T celle adoptivoverføring og LCMV infeksjon hos mus, CD8+ effector og minne T celler spores, inkludert TRM differensiering og homeostase.
I noen barrierevev, som intestinal intraepithelial lymfocytter (IEL) rom og spyttkjertler, etablerte lymfocytt isolasjon prosedyre gir høy prosentandel av TRM celler med minimal blodbåren T celleforurensning i mus LCMV modell11. Men i ikke-barriere vev, som nyrene, inneholder tett vaskulært nettverk et stort antall sirkulerende CD8+ T-celler. Det har blitt godt dokumentert at selv vellykket perfusjon ikke effektivt kan fjerne alle sirkulerende CD8+ T-celler. For å overvinne denne tekniske hindringen, intravaskulær antistoff farging har blitt etablert som en av de mest brukte teknikker i TRM laboratorier12. Kort sagt, 3-5 minutter før eutanasi, leveres 3 μg/mus anti-CD8 antistoff (for å merke CD8+ T-celler) intravenøst. Intakt blodkarvegg forhindrer rask diffusjon av antistoffet innen denne korte tidsperioden (det vil at 3-5 minutter) og bare intravaskulære celler er merket. Etter standard lymfocytt isolasjonsprotokoll, intravaskulær versus ekstravaskulære celler kan lett skilles ved hjelp av flytcytometri.
Her vil vi beskrive en standardprotokoll som vanligvis brukes i TRM-laboratorier for å utføre intravaskulær merking, lymfocyttisolering og strømningscytometrianalyse av nyre-CD8+ T-celler ved hjelp av en C57BL/6-mus som har mottatt CD45.1+ P14 T-celler og LCMV-infeksjon 30 dager før13. Samme protokoll kan brukes til å studere både effector og minne T-celler i nyrene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som vevsspesifikk immunitet er et raskt voksende forskningsområde, akkumulerende bevis tyder på at immunceller, spesielt lymfocytter befolkningen kan identifiseres i nesten alle organer i voksne mennesker eller infiserte eller immuniserte mus. LCMV mus infeksjon modell er en veletablert modell for å studere antigen-spesifikk T celle respons, effektor og minne T celle differensiering inkludert TRM biologi på tvers av flere vev. Her beskrev vi en protokoll for å analysere CD8+ T-celler i nyrene. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes av NIH tilskudd AI125701 og AI139721, Cancer Research Institute CLIP program og American Cancer Society gi RSG-18-222-01-LIB til N.Z. Vi takker Karla Gorena og Sebastian Montagnino fra Flow Cytometry Facility. Data generert i Flow Cytometry Shared Resource Facility ble støttet av University of Texas Health Science Center i San Antonio (UTHSCSA), NIH/NCI-stipend P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] ved UTHSCSA) og UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
Riferimenti
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
