Dynamisk cellebilledbehandling i superopløsning af undercellulære strukturer
Summary
Præsenteret her er en protokol for super-opløsning levende celle billeddannelse i intakt væv. Vi har standardiseret betingelserne for billeddannelse en meget følsom voksen stamcellepopulation i sit oprindelige væv miljø. Denne teknik indebærer balancering af tidsmæssige og rumlige opløsning for at give mulighed for direkte observation af biologiske fænomener i levende væv.
Abstract
Der har længe været en afgørende afvejning mellem rumlig og tidsmæssig opløsning i billeddannelse. Billeddannelse ud over lysgrænsen har traditionelt været begrænset til kun at blive brugt på faste prøver eller levende celler uden for væv mærket med stærkt lysstofrør. Nuværende super-opløsning levende celle billeddannelse teknikker kræver brug af særlige fluorescens sonder, høj belysning, flere billedopsamlinger med post-erhvervelse behandling, eller ofte en kombination af disse processer. Disse forudsætninger begrænser i væsentlig grad de biologiske prøver og sammenhænge, som denne teknik kan anvendes på.
Her beskriver vi en metode til at udføre superopløsning (~140 nm XY-opløsning) time-lapse fluorescens levende celle imaging in situ. Denne teknik er også kompatibel med lav fluorescerende intensitet, for eksempel EGFP eller mCherry endogent mærket ved lavt udtrykte gener. Som et principbevis har vi brugt denne metode til at visualisere flere subcellulære strukturer i Drosophila-testis. Under vævsforberedelse opretholdes både cellestrukturen og vævsmorfologien inden for de dissekerede testis. Her bruger vi denne teknik til at afbilde mikrotubuledynamik, samspillet mellem mikrotubuli og den nukleare membran samt fastgørelse af mikrotubuli til centromerer.
Denne teknik kræver særlige procedurer i prøveforberedelse, prøvemontering og immobilisering af prøver. Derudover skal prøverne opbevares i flere timer efter dissektion uden at gå på kompromis med cellulær funktion og aktivitet. Mens vi har optimeret betingelserne for levende super-opløsning billeddannelse specifikt i Drosophila mandlige kønsceller (GSC’ er) og stamceller i stamceller i dissekeret testis væv, denne teknik er bredt anvendelig til en række forskellige celletyper. Evnen til at observere celler under deres fysiologiske forhold uden at ofre hverken rumlig eller tidsmæssig opløsning vil tjene som et uvurderligt værktøj for forskere, der søger at løse afgørende spørgsmål i cellebiologi.
Introduction
Visualisering af subcellulære strukturer og proteindynamik i levende celler med opløsning ud over lysets diffraktionsgrænse er typisk meget udfordrende1-3. Mens flere super-opløsning teknikker såsom stokastisk-optisk-rekonstruktion-mikroskopi (STORM), Foto-Aktiveret-Lokalisering-Mikroskopi (PALM) og Stimuleret-Emission-Depletion (STED)4,5,6 mikroskopi er blevet udviklet, komplikationer i prøven forberedelse samt behovet for at opretholde levedygtighed og aktivitet ex vivo, begrænse brugen af konventionelle super-opløsning mikroskopi til billedbehandling levende prøver. Konventionel konfokal mikroskopi kan ikke opnå rumlig opløsning ud over ~230 nm XY-opløsning og er ofte utilstrækkelig til at observere indviklede cellulære understrukturer5,6. Men en nylig udvikling i konfokal mikroskopi, Airyscan super-opløsning billedbehandling, er i stand til at opnå ca 140 nm (XY-opløsning)7,8 og har en forholdsvis enkel prøve forberedelse, der er kompatibel med levende billedbehandling. Da dette billeddetekteringssystem kræver lang anskaffelsestid, kommer dets høje rumlige opløsning på bekostning af tidsmæssig opløsning9. Derfor er der brug for en metode til at sikre, at billeddannelse af levende celler udvides med høj rumlig opløsning.
Her udviklede vi en metode til observation af levende celler i intakt væv ved sin optimale opløsning til at dechifrere subcellulære strukturer med detaljerede rumlige oplysninger. Denne metode er udformet som sådan, så prøverne kan monteres stabilt i en lang periode (~ 10 h) uden at bevæge sig eller degenerere. De levende cellemedier, der bruges i denne teknik, kan understøtte cellulær funktion og undgå fotobleaching i op til 10 timer under et mikroskop i superopløsning. Endelig minimerer denne protokol de fleste belastninger forårsaget af den konstante belysning af lasere over længere tid, såsom hypoxi, ændringer i fugtighed og temperatur samt næringsstofudtømning.
Ved hjælp af denne protokol til at afbilde Drosophila mandlige kønsceller (GSC’er), var vi i stand til at observere, hvordan mikrotubulis asymmetriske aktivitet giver mulighed for præferenceinteraktion med epigenetisk forskellige søsterkromatiderne10,11,12,13. Disse typer af cellulære hændelser er meget dynamiske og er meget vanskelige at visualisere i levende celler ved hjælp af andre superopløsningsbilleddannelsesmetoder som STORM, PALM eller STED. Vi forventer, at denne metode vil blive meget nyttig for cellebiologer, da de sigter mod at forstå de dynamiske subcellulære strukturer af levende celler, der er bosiddende i væv. Der er mange områder, hvor denne metode kan anvendes til, såsom at studere proteindynamikken; forståelse af cellernes bevægelser og afstamningssporing og cellulære differentieringsprocesser, blandt andre mulige applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroskopimetoder med superopløsning giver rumlig opløsning helt op til 10’erne af nanometer4,5,6. STORM- og PALM-mikroskopimetoderne tillader opløsning på op til 20 til 50 nm (XY-opløsning), mens STED-mikroskopi giver en opløsning på 20 til 100 nm (XY-opløsning). Sim-mikroskopiens rumlige opløsning er begrænset til 100 til 130 nm15. Men på grund af sin høje fotontæthed og lange anskaffelsestid er det eks…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Integrated Imaging Core facilitet på Johns Hopkins University for mikroskoper og dataanalyse software. Vi takker J. Snedeker og Q. E. Yu for korrekturlæsning og forslag, og X.C. lab medlemmer for nyttige diskussioner og forslag. Støttet af NIGMS/NIH R35GM127075, Howard Hughes Medical Institute, David og Lucile Packard Foundation og Johns Hopkins University startfonde (X.C.).
Materials
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. – 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. – 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
Riferimenti
- Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).
- Maddox, P. S., et al. Imaging the mitotic spindle. Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Huff, J., et al. The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan. Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging. Photonics. 4 (4), 41 (2017).
- Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).
- Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).
- Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells. Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).
- Wooten, M., et al. Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
