세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징
Summary
여기에 제출된 것은 손상되지 않은 조직에서 초해상도 라이브 세포 이미징을 위한 프로토콜입니다. 우리는 그것의 네이티브 조직 환경에 있는 높게 민감한 성인 줄기 세포 인구를 화상 진찰을 위한 조건을 표준화했습니다. 이 기술은 살아있는 조직에서 생물학적 현상의 직접적인 관찰을 허용하는 시간적 및 공간 해상도의 균형을 포함한다.
Abstract
이미징에서 공간과 시간적 해상도 사이에는 오랫동안 중요한 절충이 있었습니다. 빛의 회절 한계를 넘어 화상 진찰은 전통적으로 강한 형광 신호로 표지된 조직의 외부의 고정 된 견본 또는 살아있는 세포에만 이용되는 것을 제한되었습니다. 현재 의수분해능 라이브 셀 이미징 기술은 특수 형광 프로브, 높은 조명, 인수 후 처리를 사용한 여러 이미지 수집 또는 종종 이러한 프로세스의 조합을 사용해야 합니다. 이러한 전제 조건은 이 기술이 적용될 수 있는 생물학적 샘플 및 컨텍스트를 크게 제한합니다.
여기서는 시투에서 수퍼 분해능(~140nm XY-해상도) 시간 경과 형광 라이브 세포 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 또한 낮은 형광 강도와 호환, 예를 들어, EGFP 또는 mCherry 내인성 낮은 발현 유전자에 태그. 원칙의 증거로, 우리는 Drosophila 고환에 있는 다중 세포극 구조물을 구상하기 위하여 이 방법을 이용했습니다. 조직 준비 중, 세포 구조와 조직 형태는 해부 된 고환 내에서 유지된다. 여기서는 이 기술을 사용하여 마이크로튜블러 역학, 마이크로투블러와 핵멤브레인 간의 상호 작용, 미로펠에 대한 마이크로투블러 부착을 이미지화합니다.
이 기술은 시료 준비, 시료 장착 및 시편의 고정에 특별한 절차가 필요합니다. 추가적으로, 견본은 세포 기능 및 활동을 손상시키지 않고 해부 후에 몇 시간 동안 유지되어야 합니다. 우리는 Drosophila 남성 생식선 줄기 세포 (GSCs) 및 해부 된 고환 조직에서 선천성 세균 세포에서 특히 살아있는 슈퍼 해상도 이미징을위한 조건을 최적화했지만,이 기술은 다양한 다른 세포 유형에 광범위하게 적용됩니다. 공간적 또는 현세적 해상도를 희생하지 않고 생리학적 조건하에서 세포를 관찰하는 능력은 세포 생물학에서 중요한 질문을 해결하려는 연구진에게 귀중한 도구가 될 것입니다.
Introduction
빛의 회절 한계를 넘어 분해와 라이브 세포에서 세포 극체 구조 및 단백질 역학을 시각화하는 것은 일반적으로 매우 도전1-3. 스토차스-광학-재건-현미경 검사법(STORM), 사진 활성화-국소화-현미경검사(PALM) 및 자극-방출 고갈(STED)4,5,6 현미경 검사법과 같은 다수의 초해상도 기술이 개발되었지만, 표본 제제의 합병증뿐만 아니라 생존력 및 활동 전 생체 내 사용을 유지해야 할 필요성뿐만 아니라 종래의 초심 마이크로 이미징의 사용을 제한한다. 종래의 공초점 현미경 검사는 ~230nm XY 해상도를 넘어 공간 해상도에 도달할 수 없으며 복잡한 세포 하위 구조를 관찰하기에는 종종 충분하지 않습니다5,6. 그러나, 최근 공초점 현미경검사, Airyscan 초해상도 이미징의 개발은 약 140nm(XY-해상도)7,8을 달성할 수 있으며, 라이브 이미징과 호환되는 비교적 간단한 시료 제제를 갖는다. 이 이미징 감지 시스템은 긴 수집 시간이 필요하기 때문에 높은 공간 해상도는 시간적 해상도9의비용으로 제공됩니다. 따라서 라이브 셀 이미징이 높은 공간 해상도로 확장되도록 하는 방법이 필요합니다.
여기서, 우리는 상세한 공간 정보로 세포 극체 구조를 해독하기 위한 최적 해상도로 그대로 조직으로 살아있는 세포를 관찰하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 시료를 이동하거나 퇴행성없이 장시간(~10시간) 동안 안정적으로 장착할 수 있도록 설계되었습니다. 이 기술에 사용되는 살아있는 세포 매체는 세포 기능을 지원하고 초해상도 현미경으로 최대 10 시간 동안 표백을 피할 수 있습니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 저산소증, 습도 및 온도 의 변화, 영양소 피로와 같은 오랜 기간 동안 레이저의 지속적인 조명으로 인한 대부분의 스트레스를 최소화합니다.
이 프로토콜을 사용하여 Drosophila 남성 생식선 줄기 세포 (GSC)를 이미지, 우리는 마이크로 투비의 비대칭 활동이 후생 유전학적으로 구별 자매 크로마티드와 우선 상호 작용을 허용하는 방법을 관찰 할 수 있었다10,11,12,13. 이러한 유형의 세포 이벤트는 매우 역동적이며 STORM, PALM 또는 STED와 같은 다른 초해상도 이미징 방법을 사용하여 라이브 셀에서 시각화하기가 매우 어렵습니다. 우리는 이 방법이 조직에 거주하는 살아있는 세포의 동적 세포 극성 구조를 이해하는 것을 목표로 세포 생물학자에게 매우 유용해질 것으로 예상합니다. 이 방법은 단백질의 역학을 공부하는 것과 같은 많은 지역에 적용될 수 있습니다; 세포의 움직임을 이해; 및 계보 추적 및 셀룰러 분화 프로세스, 다른 가능한 응용 프로그램 중.
Protocol
Representative Results
Discussion
초해상도 현미경 법은 나노미터4,5,6의10초까지 높은 공간 해상도를 제공한다. STORM 및 PALM 현미경 검사법은 최대 20~50nm(XY 해상도)의 해상도를 허용하며, STED 현미경 검사법은 20~100nm(XY 해상도)의 해상도를 제공합니다. SIM 현미경 검사법의 공간 해상도는 100nm15로제한됩니다. 그러나, 그것의 높은 광자 밀도 및 긴 취득 시간…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 현미경 및 데이터 분석 소프트웨어에 대한 존스 홉킨스 대학의 통합 이미징 코어 시설에 감사드립니다. J. 스네데커와 Q. E. 유에게 교정과 제안을 해주신 것에 대해 감사드리며, X.C. NIGMS/NIH R35GM127075, 하워드 휴즈 의학 연구소, 데이비드와 루실 패커드 재단, 존스 홉킨스 대학 스타트업 펀드(X.C.)가 지원합니다.
Materials
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. – 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. – 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
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