小鼠B细胞发育的流式细胞学表征
Summary
我们在这里描述了通过流式细胞术对腹膜，脾脏和骨髓组织中小鼠免疫B细胞室异质性的简单分析。该协议可以适应并扩展到其他小鼠组织。
Abstract
广泛的研究已经表征了鼠B细胞在继发性淋巴器官中的发育和分化。B细胞分泌的抗体已被分离出来，并发展成为成熟的治疗方法。在自身免疫易发小鼠或具有修饰免疫系统的小鼠中，小鼠B细胞发育的验证是在小鼠中开发或测试治疗剂的关键组成部分，并且是流式细胞术的适当使用。完善的B细胞流式细胞术参数可用于评估小鼠腹膜，骨髓和脾脏中的B细胞发育，但必须遵守许多最佳实践。此外，B细胞区室的流式细胞术分析也应该补充B细胞发育的额外读数。使用该技术生成的数据可以进一步了解野生型，自身免疫易发小鼠模型以及可用于产生抗体或抗体样分子作为治疗的人源化小鼠。
Introduction
单克隆抗体日益成为许多人类疾病的首选疗法，因为它们已成为主流医学的一部分1，2。我们之前已经描述了基因工程小鼠，其有效地产生具有小鼠IgH常数的完全人类可变区域的抗体3，4。最近，我们描述了基因工程小鼠，它们产生具有独特抗原结合的抗体样分子5。抗体由B细胞分泌，形成适应性体液免疫的基础。有两种不同类型的B细胞，B-1和B-2。在哺乳动物中，B-1细胞起源于胎儿肝脏，出生后富集于粘膜组织以及胸膜和腹膜腔，而B-2细胞在出生前起源于胎儿肝脏，此后起源于骨髓（BM）。B-2细胞富集于继发性淋巴器官，包括脾脏和血液6，7，8。在BM中，B-2造血祖细胞在Ig mu重链重排开始时开始分化为前B细胞9，10。Ig重链的成功重排及其组装到前B细胞受体（前BCR）中，以及信号传导和增殖扩增，导致分化为前B细胞。在B前细胞重新排列其Ig kappa（Igκ）之后，或者如果无效，则Ig lambda（Igλ）轻链，它们与μ重链配对，导致表面IgM BCR表达。重要的是要指出，已知IgM表面表达在自身反应性条件下降低，从而有助于功能无反应或无能B细胞的自耐受性11，12。未成熟的B细胞随后进入过渡阶段，在那里它们开始共表达IgD并从BM迁移到脾脏。在脾脏中，IgD表达进一步增加，细胞成熟为过渡B细胞的第二阶段，随后完成其成熟状态并发育为边缘区（MZ）或滤泡（Fol）细胞13，14，15。在成年小鼠中，在非疾病环境中，尽管BM中每天产生1000-2000万个未成熟的B细胞，但成熟B细胞的数量保持不变。其中，只有百分之三进入成熟B细胞池。外周B细胞室的大小受到细胞死亡的限制，部分原因是几个因素，包括自我反应性和不完全成熟16，17，18。流式细胞术分析已被广泛用于表征和枚举人类和小鼠中的许多免疫细胞亚区室。虽然人类和小鼠B细胞区室之间存在一些相似之处，但该协议仅适用于小鼠B细胞的分析。该协议的开发目的是对基因工程小鼠进行表型分析，以确定遗传操作是否会改变B细胞发育。流式细胞术在许多其他应用中也非常受欢迎，包括测量细胞活化，功能，增殖，循环分析，DNA含量分析，凋亡和细胞分选 19，20。
流式细胞术是表征小鼠和人类各种淋巴细胞区室的首选工具，包括脾脏，BM和血液等复杂器官。由于广泛用于流式细胞术的小鼠特异性抗体试剂，该技术不仅可用于研究细胞表面蛋白，还可用于研究细胞内磷酸蛋白和细胞因子，以及功能读数21。在这里，我们展示了流式细胞术试剂如何用于鉴定B细胞亚群，因为它们在继发性淋巴器官中成熟和分化。在优化染色条件，样品处理，正确的仪器设置和数据采集以及最终的数据分析之后，可以利用小鼠B细胞区室的综合流式细胞术分析方案。这种全面的分析基于Hardy及其同事设计的数十年前的命名法，其中发育的BM B-2细胞可以根据其表达的B220，CD43，BP-1，CD24，IgM和IgD22分为不同的组分（部分）。Hardy等人表明，B220+ CD43 BM B细胞可以基于BP-1和CD24（30F1）表达细分为四个亚群（分数A-C’），而B220 + CD43-（暗度至负）BM B细胞可以基于IgD和表面IgM23的差异表达分为三个子集（分数D-F）。A组分（前B细胞）定义为BP-1-CD24（30F1）–，B组分（早期前B细胞）定义为BP-1-CD24（30F1）+，C组（晚期前B细胞）定义为BP-1+ CD24（30F1）+，C级（早期前B细胞）定义为BP-1+和CD24high。此外，D组（前B细胞）被定义为B220 + CD43– IgM– B细胞，而E级（新生成的B细胞，未成熟和过渡的组合）被定义为B220 + CD43– IgM + B细胞，部分F（成熟，再循环B细胞）被定义为B220high CD43– IgM + B细胞。 相比之下，根据CD93，CD23和IgM的表达，在脾脏中发现的大多数幼稚B细胞可分为成熟（B220 + CD93–）B细胞和过渡（T1，T2，T3）细胞。成熟的B细胞可以根据IgM和CD21 / CD35的表达分解为边缘区和卵泡亚群，并且根据其IgM和IgD表面表达水平，卵泡亚群可以进一步分为成熟的滤泡I型和卵泡II型B细胞亚群24。这些脾B细胞群主要表达Igκ轻链。最后，文献中描述了起源于胎儿肝脏并主要存在于成年小鼠腹膜和胸膜腔中的B-1 B细胞群。这些腹膜B细胞可以通过缺乏CD23表达来与先前描述的B-2 B细胞区分开来。然后，它们被进一步细分为B-1a或B-1b种群，前者由CD5的存在定义，后者由其不存在来定义25。B-1细胞祖细胞在胎儿肝脏中丰富，但在成人BM中未发现。虽然B-1a和B-1b细胞来自不同的祖细胞，但它们都接种腹膜和胸膜腔24。与B-2细胞相比，B-1细胞具有独特的自我更新能力，并负责产生天然IgM抗体。
在许多情况下，B细胞发育中的缺陷可能会出现，包括BCR26，27成分的缺陷，影响BCR信号传导强度的信号分子的扰动14，28，29，或调节B细胞存活的细胞因子的破坏30，31.淋巴管室的流式细胞术分析有助于表征这些小鼠和许多其他小鼠中的B细胞发育块。淋巴管室流式细胞术分析的一个优点是，它能够对从活解离组织获得的单个细胞进行测量。在不断扩大的荧光团范围内，试剂的可用性允许同时分析多个参数，并能够评估B细胞异质性。此外，通过流式细胞术分析枚举B细胞补充了其他免疫学测定，例如免疫组织化学方法，可视化淋巴器官内的细胞定位，检测循环抗体水平作为体液免疫的衡量标准，以及两个光子显微镜来测量B细胞在真实空间和时间上的反应32。
Protocol
Representative Results
Discussion
自20世纪80年代以来，淋巴和非淋巴组织的流式细胞术分析使小鼠和人类中的B细胞亚群能够同时鉴定和枚举。它已被用作体液免疫的衡量标准，可以进一步用于评估B细胞功能。该方法利用试剂的可用性来评估小鼠和人类B细胞成熟的不同阶段，通过同时分析多个参数，即使在罕见的人群中也能评估B细胞异质性。如果用于测量复杂的异质性样品，它可以在几分钟内检测单个细胞上的亚群<sup class="xref"…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢马修·斯利曼（Matthew Sleeman）对手稿的批判性阅读。我们还感谢Regeneron的Vivarium运营和流式细胞术核心部门对这项研究的支持。
Materials
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
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