Flow cytometrisk karakterisering af Murine B Cell Development
Summary
Vi beskriver heri en simpel analyse af heterogeniteten af murin immun B celle rum i bughinden, milt, og knoglemarvsvæv ved flow cytometri. Protokollen kan tilpasses og udvides til andre musevæv.
Abstract
Omfattende undersøgelser har karakteriseret udviklingen og differentiering af murin B-celler i sekundære lymfoide organer. Antistoffer udskilles af B-celler er blevet isoleret og udviklet til veletablerede terapier. Validering af murin B-celleudvikling i forbindelse med autoimmune mus eller hos mus med modificeret immunforsvar er en afgørende komponent i udvikling eller test af terapeutiske midler hos mus og er en passende anvendelse af flowcytometri. Veletablerede B celle flow cytometri parametre kan bruges til at evaluere B celle udvikling i murin peritoneum, knoglemarv, og milt, men en række bedste praksis skal overholdes. Derudover bør flowcytometrisk analyse af B-cellerum også supplere yderligere udlæsninger af B-celleudvikling. Data genereret ved hjælp af denne teknik kan fremme vores forståelse af vilde type, autoimmune tilbøjelige musemodeller samt humaniserede mus, der kan bruges til at generere antistof eller antistoflignende molekyler som terapi.
Introduction
Monoklonale antistoffer er i stigende grad blevet den foretrukne terapi for mange menneskelige sygdomme, som de bliver en del af mainstream medicin1,2. Vi har tidligere beskrevet genetisk manipulerede mus, som effektivt producerer antistoffer, der huser fuldt menneskelige variable regioner med mus IgH konstanter3,4. Senest har vi beskrevet genetisk manipulerede mus, der producerer antistoflignende molekyler, der har forskellige antigenbindinger5. Antistoffer udskilles af B-celler og danner grundlaget for adaptiv humoral immunitet. Der er to forskellige typer B-celler, B-1 og B-2. Hos pattedyr stammer B-1-celler i fosterlever og beriges i slimhindevæv og pleural- og bughulen efter fødslen, mens B-2-celler stammer fra fosterlever før fødslen og derefter i knoglemarven (BM). B-2 celler er beriget i sekundære lymfoid organer, herunder milten og blod6,7,8. I BM, B-2 hæmatoopoietic forfædre begynder at differentiere sig til pro-B celler ved indledningen af Ig mu tunge kæde omlægning9,10. Vellykket omlægning af Ig tung kæde og dens samling i præ-B celle receptor (pre-BCR), sammen med signalering og proliferative ekspansion, fører til differentiering til præ-B celler. Efter pre-B celler omarrangere deres Ig kappa (Igκ), eller hvis uproduktive, Ig lambda (Igλ) lyskæder, de par med μ tung kæde, hvilket resulterer i overflade IgM BCR udtryk. Det er vigtigt at påpege, at IgM overflade udtryk er kendt for at være reduceret under betingelser for autoreaktivitet, hvilket bidrager til selvtolerance i funktionelt ikke reagerer eller anergiske B-celler11,12. Umodne B-celler går derefter ind i en overgangsfase, hvor de begynder at co-udtrykke IgD og migrere fra BM til milten. I milten øges IgD-udtrykket yderligere, og cellerne modnes til en anden fase af overgangs B-celler, efterfulgt af færdiggørelse af deres modningsstatus og udvikling til enten marginalzone (MZ) eller follikulære (Fol) celler13,14,15. Hos voksne mus, i en ikke-syge indstilling, forbliver antallet af modne B-celler konstant på trods af at 10-20 millioner umodne B-celler genereres dagligt i BM. Af disse kommer kun tre procent ind i puljen af modne B-celler. Størrelsen af det perifere B-cellerum er begrænset af celledød, til dels på grund af flere faktorer, herunder selvreaktivitet og ufuldstændig modning16,17,18. Flow cytometrisk analyse er blevet flittigt brugt til at karakterisere og opregne mange immuncelleunderrum hos mennesker og mus. Mens der er nogle ligheder mellem menneskelige og murin B celle rum, denne protokol gælder kun for analyse af murin B-celler. Denne protokol blev udviklet med det formål at phenotyping genetisk manipulerede mus, at afgøre, om genmanipulation ville ændre B celle udvikling. Flow cytometri har også været enormt populær i mange ekstra applikationer, herunder i måling af celleaktivering, funktion, spredning, cyklusanalyse, DNA-indholdsanalyse, apoptose og cellesortering 19,20.
Flowcytometri er det foretrukne værktøj til at karakterisere forskellige lymfocytrum hos mus og mennesker, herunder i komplekse organer som milten, BM og blod. På grund af bredt tilgængelige musespecifikke antistofreagenser til flowcytometri kan denne teknik bruges til at undersøge ikke kun celleoverfladeproteiner, men også intracellulære fosfoproteiner og cytokiner samt funktionelle udlæsninger21. Heri demonstrerer vi, hvordan flowcytometri reagenser kan bruges til at identificere B-celler subsets som de modnes og differentiere i sekundære lymfoide organer. Efter optimering af farvningsforhold kan prøvehåndtering, korrekt instrumentopsætning og dataindsamling og endelig dataanalyse anvendes en protokol til omfattende flowcytometrisk analyse af B-cellerummet i mus. En sådan omfattende analyse er baseret på en årtier gammel nomenklatur udtænkt af Hardy og kolleger, hvor udvikling af BM B-2 celler kan opdeles i forskellige fraktioner (Fraction) afhængigt af deres udtryk for B220, CD43, BP-1, CD24, IgM og IgD22. Hardy et al., viste, at B220+ CD43 BM B-celler kan opdeles i fire undersæt (B-C’) på basis af BP-1- og CD24 (30F1) udtryk, mens B220+ CD43-(dim to neg) BM B-celler kan oversættes til tre delsæt (Brøk D-F) baseret på differentialudtryk af IgD og overflade IgM23. Brøk A (præ-pro-B-celler) defineres som BP-1– CD24 (30F1)–, Brøk B (tidlige pro-B-celler) defineres som BP-1– CD24 (30F1)+, Brøk C (sene pro-B-celler) defineres som BP-1+ CD24 (30F1)+, og Brøk C’ (tidlige før-B-celler) defineres som BP-1+ og CD24high. Desuden defineres B220+ CD43– IgM– B-celler, og Brøk E (nygenererede B-celler, kombination af umodne og midlertidige) defineres som B220+ CD43- IgM+ B-celler, og Brøk F (modne, recirkulerende B-celler) defineres som B220high CD43– IgM+ B-celler. I modsætning hertil kan de fleste naive B-celler, der findes i milten, opdeles i modne (B220+ CD93-) B-celler og overgangsceller (T1, T2, T3) afhængigt af udtryk for CD93, CD23 og IgM. Modne B-celler kan løses i marginalzone og follikulære undersæt baseret på udtryk af IgM og CD21/CD35, og follikulære undersæt kan yderligere opdeles i modne follikulær type I og follikulær type II B celleundersæt afhængigt af niveauet af deres IgM og IgD overfladeudtryk24. Disse milnic B cellepopulationer udtrykker overvejende Igκ lyskæde. Endelig er B-1 B-cellepopulationer, der stammer fra fosterlever og hovedsageligt findes i de peritoneale og pleuralhulrum hos voksne mus, blevet beskrevet i litteraturen. Disse peritoneale B-celler kan skelnes fra de tidligere beskrevne B-2 B-celler ved deres mangel på CD23-udtryk. De er derefter yderligere opdelt i B-1a eller B-1b populationer, med førstnævnte defineret af tilstedeværelsen af CD5 og sidstnævnte ved dens fravær25. B-1 celle forfædre er rigelige i fosterlever, men findes ikke i voksen BM. Mens B-1a og B-1b celler stammer fra forskellige forfædre, de begge frø bugnende og pleural hulrum24. I modsætning til B-2-celler er B-1-celler unikt i stand til selvfornyelse og er ansvarlige for produktion af naturlige IgM antistoffer.
Defekter i B-celleudvikling kan opstå i mange tilfælde, herunder mangler i komponenterne i BCR26,27, forstyrrelser af signalmolekyler, der påvirker BCR signaleringsstyrke14,28,29, eller forstyrrelse af cytokiner, der modulerer B-celleoverlevelse30,31 . Flow cytometri analyse af lymfoid rum har bidraget til karakterisering af B celle udvikling blokke i disse mus og mange andre. En fordel ved flowcytometrisk analyse af lymfoidrum er, at det giver mulighed for at foretage målinger på individuelle celler, der er fremstillet af levende dissocieret væv. Tilgængeligheden af reagenser i et stadigt voksende udvalg af fluorophorer giver mulighed for samtidig analyse af flere parametre og muliggør vurdering af B-celle heterogenitet. Desuden, optælling af B-celler ved flow cytometri analyse supplerer andre immunologiske assays såsom immunohistochemistry metoder, der visualiserer celle lokalisering i lymfoid organer, påvisning af cirkulerende antistofniveauer som et mål for humoral immunitet, samt to foton mikroskopi til at måle B celle svar i realtid og tid32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flow cytometrisk analyse af lymfoide og ikke-lymfoide væv har gjort det muligt samtidig identifikation og optælling af B-celle delpopulationer i mus og mennesker siden 1980’erne. Det er blevet brugt som et mål for humoral immunitet og kan anvendes yderligere til at evaluere B-cellefunktionalitet. Denne metode udnytter reagensets tilgængelighed til at vurdere forskellige stadier af B-cellemodning hos mus og mennesker ved samtidig analyse af flere parametre, der muliggør vurdering af B-celle heterogenitet, selv i sjæ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Matthew Sleeman for den kritiske læsning af manuskriptet. Vi takker også Vivarium Operations og Flow Cytometry Core afdelinger på Regeneron for at støtte denne forskning.
Materials
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
Riferimenti
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
- Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
- Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
- Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
- Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
- Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
- von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
- Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
- Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
- Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
- Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
- Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
- Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
- Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
- Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
- McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
- Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
- Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
- Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
- Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
- Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
- Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
- Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
- Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
- Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
- Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
- Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , 21 (2007).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).
