אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B
Summary
אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.
Abstract
מחקרים מקיפים אפיינו את ההתפתחות וההבחנה של תאי מורין B באיברי לימפה משניים. נוגדנים המופרשים על ידי תאי B בודדו ופותחו לטיפולים מבוססים היטב. אימות התפתחות תאי מורינה B, בהקשר של עכברים נוטים לחיסון עצמי, או בעכברים עם מערכת חיסונית שונה, הוא מרכיב חיוני בפיתוח או בדיקה של חומרים טיפוליים בעכברים והוא שימוש מתאים בציטומטריית זרימה. פרמטרים ציטומטריים של זרימת תאי B מבוססים היטב יכולים לשמש להערכת התפתחות תאי B בצפק המורין, במח העצם ובטחול, אך יש לדבוק במספר שיטות עבודה מומלצות. בנוסף, ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי B צריך גם להשלים קריאות נוספות של פיתוח תא B. נתונים הנוצרים בטכניקה זו יכולים לקדם את הבנתנו בסוג פראי, מודלים של עכבר מועד אוטואימוניות, כמו גם עכברים אנושיים שניתן להשתמש בהם כדי ליצור מולקולות דמויות נוגדנים או נוגדנים כטיפולים.
Introduction
נוגדנים חד שבטיים הפכו יותר ויותר לטיפול הבחירה במחלות אנושיות רבות כאשר הם הופכים לחלק מהרפואה המיינסטרים1,2. תיארנו בעבר עכברים מהונדסים גנטית המייצרים ביעילות נוגדנים המעניקים מחסה לאזורים משתנים אנושיים לחלוטין עם קבועי עכבר IgH3,4. לאחרונה, תיארנו עכברים מהונדסים גנטית המייצרים מולקולות דמויות נוגדנים שיש להן אנטיגן מחייב מובהק5. נוגדנים מופרשים על ידי תאי B ומהוות את הבסיס לחסינות הומוריסטית אדפטיבית. ישנם שני סוגים שונים של תאי B, B-1 ו- B-2. ביונקים, תאי B-1 מקורם בכבד העוברי ומועשרים ברקמות הרירית ובחללים הפלורליים הצפקיים לאחר הלידה, בעוד שתאי B-2 מקורם בכבד העוברי לפני הלידה ולאחר מכן במח העצם (BM). תאי B-2 מועשרים באיברי לימפה משניים כולל הטחול והדם6,7,8. ב- BM, אבות ההמטויאטי B-2 מתחילים להבדיל לתאי פרו-B עם תחילת ארגון מחדש של שרשרת כבדה Ig mu9,10. סידור מחדש מוצלח של שרשרת כבדה Ig והרכבתה לתוך קולטן התא טרום B (טרום BCR), יחד עם איתות והתרחבות שגשוג, מובילים לבידול לתאי טרום B. לאחר שתאי טרום-B מסדרים מחדש את שרשראות האור של Ig kappa (Igκ), או אם הם אינם יצרניים, שרשראות האור של Ig lambda (Igλ), הם משתלבים עם שרשרת μ כבדה, וכתוצאה מכך ביטוי IgM BCR משטחי. חשוב לציין כי ביטוי פני השטח של IgM ידוע להיות מופחת בתנאים של פעילות אוטומטית, ובכך תורם סובלנות עצמית בתאי B לא מגיבים פונקציונלית או אלרגית11,12. תאי B לא בוגרים נכנסים לשלב מעבר, שבו הם מתחילים לבטא IgD ולעבור מה- BM לטחול. בטחול, ביטוי IgD גדל עוד יותר והתאים מבשילים לשלב שני של תאי B מעבר, ולאחר מכן השלמת מצב ההתבגרות שלהם והתפתחות לתוך אזור שולי (MZ) או תאי זקיקים (Fol)13,14,15. בעכברים בוגרים, בסביבה שאינה חולה, מספר תאי B בוגרים נשאר קבוע למרות 10-20 מיליון תאי B לא בוגרים הנוצרים מדי יום ב- BM. מתוכם, רק שלושה אחוזים נכנסים למאגר של תאי B בוגרים. גודל תא B ההיקפי מוגבל על ידי מוות תאי, בין היתר בשל מספר גורמים כולל תגובה עצמית והתבגרות חלקית16,17,18. ניתוח ציטומטרי זרימה שימש בהרחבה כדי לאפיין ולספור תאים רבים של תאי מערכת החיסון בבני אדם ועכברים. אמנם יש כמה קווי דמיון בין תאים אנושיים מורין B, פרוטוקול זה חל רק על ניתוח של תאי מורין B. פרוטוקול זה פותח במטרה פנוטיפינג עכברים מהונדסים גנטית, כדי לקבוע אם מניפולציה גנטית תשנה את התפתחות תאי B. Cytometry זרימה היה גם פופולרי מאוד ביישומים רבים נוספים, כולל במדידת הפעלת התא, פונקציה, התפשטות, ניתוח מחזור, ניתוח תוכן DNA, אפופטוזיס ומיון תאים 19,20.
ציטומטריית זרימה היא הכלי המועדף לאפיין תאי לימפוציטים שונים בעכברים ובבני אדם, כולל באיברים מורכבים כגון הטחול, ה- BM והדם. בשל ריאגנטים נוגדנים ספציפיים לעכבר עבור ציטומטריית זרימה, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור לא רק חלבונים פני התא, אלא גם פוספורוטאין תאיים וציטוקינים, כמו גם קריאות פונקציונליות21. כאן אנו מדגימים כיצד ריאגנטים ציטומטריה זרימה ניתן להשתמש כדי לזהות תת קבוצות תאי B כפי שהם בוגרים להבדיל באיברים לימפואידיים משניים. לאחר אופטימיזציה של תנאי כתמים, טיפול בדגימות, הגדרת מכשיר נכון ורכישת נתונים, ולבסוף ניתוח נתונים, פרוטוקול לניתוח ציטומטרי זרימה מקיף של תא B בעכברים ניתן להשתמש. ניתוח מקיף כזה מבוסס על המינוח בן עשרות השנים שהומצא על ידי הארדי ועמיתיו, שבו ניתן לחלק תאי BM B-2 מתפתחים לשברים שונים (Fraction) בהתאם לביטוי שלהם של B220, CD43, BP-1, CD24, IgM ו- IgD22. הארדי ואח’, הראו כי ניתן לחלק תאי BM BM B B220+ CD43 לארבע קבוצות משנה (שבר A-C’) על בסיס ביטוי BP-1 ו- CD24 (30F1), בעוד שתאי B220+ CD43-(עמום עד שלילי) BM B יכולים להיפתר לשלוש קבוצות משנה (שבר D-F) בהתבסס על ביטוי דיפרנציאלי של IgD ו- IgM23 פני השטח. שבר A (תאי טרום-PRO-B) מוגדרים כ- BP-1– CD24 (30F1)–, שבר B (תאים מוקדמים של פרו-B) מוגדרים כ- BP-1– CD24 (30F1)+, שבר C (תאי Pro-B מאוחרים) מוגדרים כ- BP-1+ CD24 (30F1)+, ושבר C’ (תאים מוקדמים לפני B) מוגדרים כ- BP-1+ ו- CD24high. יתר על כן, שבר D (תאים לפני B) מוגדרים כתאי B220+ CD43– IgM– B, ו- Fraction E (תאי B שנוצרו לאחרונה, שילוב של תאים לא בוגרים ומעבריים) מוגדרים כתאי B220+ CD43– IgM+ B ו- Fraction F (תאים בוגרים, חוזרים על B) מוגדרים כתאי B220high CD43– IgM + B. לעומת זאת, ניתן לחלק את רוב תאי B הנאיביים שנמצאו בטחול לתאי B בוגרים (B220+ CD93-) B ותאי מעבר (T1, T2, T3) בהתאם לביטוי של CD93, CD23 ו– IgM. ניתן לפתור תאי B בוגרים לתוך אזור שולי ותת-קבוצות זקיקים בהתבסס על ביטוי של IgM ו- CD21/CD35, וניתן לחלק עוד יותר את תת-קבוצות המשנה של הזקיקים לסוג זקיקים בוגרים I ותת-קבוצות תאים מסוג II B מסוג II בהתאם לרמת ביטוי פני השטח IgM ו- IgD24. אוכלוסיות תאי B בטחול אלה מבטאות בעיקר שרשרת אור של איגה. לבסוף, אוכלוסיות תאי B-1 B, שמקורן בכבד העובר ונמצאות בעיקר בחללים הצפקיים והפלורליים של עכברים בוגרים, תוארו בספרות. תאי B צפקיים אלה ניתן להבחין בין תאי B-2 B שתוארו בעבר על ידי חוסר ביטוי CD23 שלהם. לאחר מכן הם מחולקים עוד יותר לאוכלוסיות B-1a או B-1b, כאשר הראשון מוגדר על ידי נוכחות של CD5 והאחרון על ידי היעדרו25. אבות תאי B-1 מצויים בשפע בכבד העוברי, אך אינם נמצאים ב- BM למבוגרים. בעוד תאי B-1a ו- B-1b מקורם באבות צאצא שונים, שניהם זורעים את חללי הצפק והפלורל24. בניגוד לתאי B-2, תאי B-1 מסוגלים באופן ייחודי להתחדשות עצמית ואחראים לייצור נוגדני IgM טבעיים.
פגמים בהתפתחות תאי B יכולים להתעורר במקרים רבים, כולל ליקויים ברכיבי BCR26,27, הפרעות של מולקולות איתות המשפיעות על עוצמת איתות BCR14,28,29, או הפרעה של ציטוקינים המווסתים את הישרדות תאי B30,31 . ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי הלימפה תרם לאפיון של בלוקי פיתוח תאי B בעכברים אלה ורבים אחרים. אחד היתרונות של ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי לימפה הוא שהוא מציע את היכולת לבצע מדידות על תאים בודדים המתקבלים רקמה מנותקת חיה. הזמינות של ריאגנטים במגוון הולך וגדל של פלואורופורים מאפשרת ניתוח סימולטני של פרמטרים מרובים ומאפשרת הערכה של הטרוגניות תאי B. יתר על כן, הספירה של תאי B על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה משלימה בדיקות אימונולוגיות אחרות כגון שיטות אימונוהיסטוכימיה המדמיינת לוקליזציה של תאים בתוך איברי לימפה, זיהוי רמות נוגדנים במחזור כמדד של חסינות הומוריסטית, כמו גם שתי מיקרוסקופיה פוטונית למדידת תגובות תאי B במרחב ובזמן אמיתיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח ציטומטרי זרימה של רקמות לימפה ולא לימפואידים אפשר זיהוי והספירה בו זמנית של תת-אוכלוסיות תאי B בעכברים ובני אדם מאז שנות השמונים. זה שימש כמדד של חסינות הומוריסטית והוא יכול להיות מיושם עוד יותר כדי להעריך פונקציונליות תא B. שיטה זו מנצלת את זמינות ריאגנט כדי להעריך שלבים שונים של התב…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למת’יו סלימן על הקריאה הביקורתית של כתב היד. אנו מודים גם למחלקות הליבה של ויווריום וציטומטריה זורמת ברגנרון על תמיכתם במחקר זה.
Materials
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
Riferimenti
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
- Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
- Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
- Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
- Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
- Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
- von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
- Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
- Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
- Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
- Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
- Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
- Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
- Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
- Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
- McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
- Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
- Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
- Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
- Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
- Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
- Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
- Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
- Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
- Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
- Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
- Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , 21 (2007).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).
