हम यहां प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पेरिटोनियम, प्लीहा और अस्थि मज्जा ऊतकों में मुरीन प्रतिरक्षा बी सेल डिब्बे की विषमता के एक सरल विश्लेषण का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है और अन्य माउस ऊतकों तक बढ़ाया जा सकता है।
व्यापक अध्ययनों ने माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में मुरीन बी कोशिकाओं के विकास और भेदभाव की विशेषता की है। बी कोशिकाओं द्वारा स्रावित एंटीबॉडी को अलग किया गया है और अच्छी तरह से स्थापित चिकित्सीय में विकसित किया गया है। ऑटोइम्यून प्रवण चूहों के संदर्भ में, या संशोधित प्रतिरक्षा प्रणाली वाले चूहों में, मुरीन बी सेल विकास का सत्यापन, चूहों में चिकित्सीय एजेंटों को विकसित करने या परीक्षण करने का एक महत्वपूर्ण घटक है और प्रवाह साइटोमेट्री का एक उपयुक्त उपयोग है। अच्छी तरह से स्थापित बी सेल प्रवाह साइटोमेट्रिक मापदंडों का उपयोग मुरीन पेरिटोनियम, अस्थि मज्जा और प्लीहा में बी सेल विकास का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन कई सर्वोत्तम प्रथाओं का पालन किया जाना चाहिए। इसके अलावा, बी सेल डिब्बों के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण को बी सेल विकास के अतिरिक्त रीडआउट को भी पूरक करना चाहिए। इस तकनीक का उपयोग करके उत्पन्न डेटा जंगली प्रकार, ऑटोइम्यून प्रोन माउस मॉडल के साथ-साथ मानवीकृत चूहों की हमारी समझ को आगे बढ़ा सकता है जिसका उपयोग एंटीबॉडी या एंटीबॉडी जैसे अणुओं को चिकित्सीय के रूप में उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी तेजी से कई मानव बीमारियों के लिए विकल्प चिकित्सा बन गए हैं क्योंकि वे मुख्यधारा की दवा 1,2 का हिस्सा बन जाते हैं। हमने पहले आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों का वर्णन किया है जो माउस IgH स्थिरांक 3,4 के साथ पूरी तरह से मानव चर क्षेत्रों को आश्रय देने वाले एंटीबॉडी का कुशलतापूर्वक उत्पादन करते हैं। हाल ही में, हमने आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों का वर्णन किया है जो एंटीबॉडी जैसे अणुओं का उत्पादन करते हैं जिनमें अलग-अलग एंटीजन-बाइंडिंग 5 होता है। एंटीबॉडी बी कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं और अनुकूली ह्यूमरस प्रतिरक्षा का आधार बनाते हैं। दो अलग-अलग प्रकार के बी कोशिकाएं हैं, बी -1 और बी -2। स्तनधारियों में, बी -1 कोशिकाएं भ्रूण के जिगर में उत्पन्न होती हैं और जन्म के बाद म्यूकोसल ऊतकों और फुफ्फुस और पेरिटोनियल गुहाओं में समृद्ध होती हैं, जबकि बी -2 कोशिकाएं जन्म से पहले भ्रूण के जिगर में उत्पन्न होती हैं और उसके बाद अस्थि मज्जा (बीएम) में होती हैं। बी -2 कोशिकाओं को प्लीहा और रक्त 6,7,8 सहित माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में समृद्ध किया जाता है। बीएम में, बी -2 हेमटोपोइएटिक पूर्वज आईजी म्यू हेवी चेन पुनर्व्यवस्था 9,10 की दीक्षा पर प्रो-बी कोशिकाओं में अंतर करना शुरू करते हैं। Ig भारी श्रृंखला की सफल पुनर्व्यवस्था और पूर्व-बी सेल रिसेप्टर (पूर्व-बीसीआर) में इसकी असेंबली, सिग्नलिंग और प्रोलिफेरेटिव विस्तार के साथ, पूर्व-बी कोशिकाओं के लिए भेदभाव की ओर जाता है। प्री-बी कोशिकाओं के बाद अपने आईजी कप्पा (आईजी) को पुनर्व्यवस्थित करते हैं, या यदि अनुत्पादक, आईजी लैम्ब्डा (आईजी) प्रकाश श्रृंखलाएं, वे μ भारी श्रृंखला के साथ जोड़ी बनाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सतह आईजीएम बीसीआर अभिव्यक्ति होती है। यह इंगित करना महत्वपूर्ण है कि IgM सतह अभिव्यक्ति को autoreactivity की शर्तों के तहत कम करने के लिए जाना जाता है, इस प्रकार कार्यात्मक रूप से अनुत्तरदायी या एनार्जिक बी कोशिकाओं में आत्म सहिष्णुता में योगदान देता है11,12। अपरिपक्व बी कोशिकाएं तब एक संक्रमणकालीन चरण में प्रवेश करती हैं, जहां वे आईजीडी को सह-व्यक्त करना शुरू कर देती हैं और बीएम से प्लीहा में स्थानांतरित होती हैं। प्लीहा में, आईजीडी अभिव्यक्ति और बढ़ जाती है और कोशिकाएं संक्रमणकालीन बी कोशिकाओं के दूसरे चरण में परिपक्व होती हैं, इसके बाद उनकी परिपक्वता स्थिति और विकास को या तो सीमांत क्षेत्र (एमजेड) या कूपिक (फोलिकुलर) कोशिकाओं में पूरा किया जाता है13,14,15। वयस्क चूहों में, एक गैर-रोगग्रस्त सेटिंग में, बीएम में दैनिक रूप से उत्पन्न होने वाली 10-20 मिलियन अपरिपक्व बी कोशिकाओं के बावजूद परिपक्व बी कोशिकाओं की संख्या स्थिर रहती है। इनमें से, केवल तीन प्रतिशत परिपक्व बी कोशिकाओं के पूल में प्रवेश करते हैं। परिधीय बी सेल डिब्बे का आकार सेल की मृत्यु से विवश होता है, जो आत्म-प्रतिक्रियाशीलता और अपूर्ण परिपक्वता 16,17,18 सहित कई कारकों के कारण होता है। फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग मनुष्यों और चूहों में कई प्रतिरक्षा कोशिका उप-डिब्बों को चिह्नित करने और गणना करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। जबकि मानव और मुरीन बी सेल डिब्बों के बीच कुछ समानताएं हैं, यह प्रोटोकॉल केवल मुरीन बी कोशिकाओं के विश्लेषण पर लागू होता है। इस प्रोटोकॉल को आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों को फेनोटाइपिंग के उद्देश्य से विकसित किया गया था, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या आनुवंशिक हेरफेर बी सेल विकास को बदल देगा। फ्लो साइटोमेट्री कई अतिरिक्त अनुप्रयोगों में भी बेहद लोकप्रिय रहा है, जिसमें सेल सक्रियण, कार्य, प्रसार, चक्र विश्लेषण, डीएनए सामग्री विश्लेषण, एपोप्टोसिस और सेल सॉर्टिंग 19,20 को मापना शामिल है।
फ्लो साइटोमेट्री चूहों और मनुष्यों में विभिन्न लिम्फोसाइट डिब्बों को चिह्नित करने के लिए पसंद का उपकरण है, जिसमें प्लीहा, बीएम और रक्त जैसे जटिल अंग शामिल हैं। प्रवाह साइटोमेट्री के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध माउस-विशिष्ट एंटीबॉडी अभिकर्मकों के कारण, इस तकनीक का उपयोग न केवल सेल सतह प्रोटीन बल्कि इंट्रासेल्युलर फॉस्फोप्रोटीन और साइटोकिन्स, साथ ही साथ कार्यात्मक रीडआउट 21 की जांच करने के लिए किया जा सकता है। इसमें हम प्रदर्शित करते हैं कि कैसे प्रवाह साइटोमेट्री अभिकर्मकों का उपयोग बी कोशिकाओं के सबसेट की पहचान करने के लिए किया जा सकता है क्योंकि वे माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में परिपक्व और अंतर करते हैं। धुंधला स्थितियों के अनुकूलन के बाद, नमूना हैंडलिंग, सही साधन सेट अप और डेटा अधिग्रहण, और अंत में डेटा विश्लेषण, चूहों में बी सेल डिब्बे के व्यापक प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। इस तरह के व्यापक विश्लेषण हार्डी और सहयोगियों द्वारा तैयार किए गए दशकों पुराने नामकरण पर आधारित है, जहां बीएम बी -2 कोशिकाओं को विकसित करने को बी 220, सीडी 43, बीपी -1, सीडी 24, आईजीएम और आईजीडी 22 की अभिव्यक्ति के आधार पर विभिन्न अंशों (अंश) में विभाजित किया जा सकता है। हार्डी एट अल. से पता चला है कि B220 + CD43 BM B कोशिकाओं को BP-1 और CD24 (30F1) अभिव्यक्ति के आधार पर चार सबसेट (अंश A-C’) में विभाजित किया जा सकता है, जबकि B220+ CD43-(dim to neg) BM B कोशिकाओं को IgD और सतह IgM23 की विभेदक अभिव्यक्ति के आधार पर तीन सबसेट (भिन्न D-F) में हल किया जा सकता है। भिन्न A (पूर्व-प्रो-बी कोशिकाओं) को BP-1– CD24 (30F1)–, भिन्न B (प्रारंभिक प्रो-B कोशिकाओं) को BP-1– CD24 (30F1)+, भिन्न C (देर से प्रो-B कोशिकाओं) को BP-1+ CD24 (30F1)+ के रूप में परिभाषित किया गया है, और अंश C ‘(प्रारंभिक पूर्व-B कोशिकाओं) को BP-1+ और CD24high के रूप में परिभाषित किया गया है। इसके अलावा, भिन्न डी (पूर्व-बी कोशिकाओं) को B220 + CD43– IgM– B कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है, और अंश E (नव उत्पन्न B कोशिकाओं, अपरिपक्व और संक्रमणकालीन का संयोजन) को B220 + CD43– IgM + B कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है और अंश F (परिपक्व, recirculting B कोशिकाओं) को B220high CD43– IgM + B कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है। इसके विपरीत, प्लीहा में पाए जाने वाले भोले बी कोशिकाओं के बहुमत को परिपक्व (B220+ CD93–) बी कोशिकाओं और संक्रमणकालीन (T1, T2, T3) कोशिकाओं में विभाजित किया जा सकता है, जो CD93, CD23 और IgM की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। परिपक्व बी कोशिकाओं को IgM और CD21/CD35 की अभिव्यक्ति के आधार पर सीमांत क्षेत्र और कूपिक उपसमुच्चय में हल किया जा सकता है, और कूपिक उपसमुच्चय को उनके IgM और IgD सतह अभिव्यक्ति 24 के स्तर के आधार पर परिपक्व कूपिक प्रकार I और कूपिक प्रकार II B सेल सबसेट में विभाजित किया जा सकता है। ये स्प्लेनिक बी सेल आबादी मुख्य रूप से Igπ प्रकाश श्रृंखला को व्यक्त करती है। अंत में, बी -1 बी सेल आबादी, जो भ्रूण के जिगर में उत्पन्न होती है और मुख्य रूप से वयस्क चूहों के पेरिटोनियल और फुफ्फुस गुहाओं में पाई जाती है, को साहित्य में वर्णित किया गया है। इन पेरिटोनियल बी कोशिकाओं को CD23 अभिव्यक्ति की कमी से पहले वर्णित B-2 B कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है। फिर उन्हें बी -1 ए या बी -1 बी आबादी में विभाजित किया जाता है, जिसमें पूर्व को सीडी 5 की उपस्थिति से परिभाषित किया जाता है और बाद में इसकी अनुपस्थिति 25 द्वारा परिभाषित किया जाता है। बी -1 सेल पूर्वज भ्रूण के जिगर में प्रचुर मात्रा में होते हैं, लेकिन वयस्क बीएम में नहीं पाए जाते हैं। जबकि बी -1 ए और बी -1 बी कोशिकाएं विभिन्न पूर्वजों से उत्पन्न होती हैं, वे दोनों पेरिटोनियल और फुफ्फुस गुहाओं को बीज देते हैं24। बी -2 कोशिकाओं के विपरीत, बी -1 कोशिकाएं आत्म-नवीकरण में विशिष्ट रूप से सक्षम हैं और प्राकृतिक आईजीएम एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं।
बी सेल विकास में दोष कई उदाहरणों में उत्पन्न हो सकते हैं, जिसमें BCR26,27 के घटकों में कमियां, सिग्नलिंग अणुओं की गड़बड़ी जो BCR सिग्नलिंग ताकत को प्रभावित करती है14,28,29, या साइटोकिन्स का विघटन जो बी सेल उत्तरजीविता को संशोधित करता है30,31 . लिम्फोइड डिब्बों के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण ने इन चूहों और कई अन्य लोगों में बी सेल विकास ब्लॉकों के लक्षण वर्णन में योगदान दिया है। लिम्फोइड डिब्बों के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण का एक लाभ यह है कि यह जीवित विघटित ऊतक से प्राप्त व्यक्तिगत कोशिकाओं पर माप करने की क्षमता प्रदान करता है। फ्लोरोफोरस की एक कभी-विस्तारित रेंज में अभिकर्मकों की उपलब्धता कई मापदंडों के एक साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देती है और बी सेल विषमता के मूल्यांकन को सक्षम बनाती है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा बी कोशिकाओं की गणना अन्य प्रतिरक्षाविज्ञानी assays जैसे immunohistochemistry विधियों को पूरक करती है जो लिम्फोइड अंगों के भीतर सेल स्थानीयकरण की कल्पना करती है, ह्यूमरस प्रतिरक्षा के उपाय के रूप में परिसंचारी एंटीबॉडी के स्तर का पता लगाती है, साथ ही साथ वास्तविक स्थान और टाइम 32 में बी सेल प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी।
लिम्फोइड और गैर-लिम्फोइड ऊतकों के फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण ने 1980 के दशक के बाद से चूहों और मनुष्यों में बी सेल उप-आबादी की एक साथ पहचान और गणना को सक्षम किया है। इसका उपयोग ह्यूमरस प्रतिरक्षा के उपाय ?…
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए मैथ्यू स्लीमैन को धन्यवाद देते हैं। हम इस शोध का समर्थन करने के लिए Regeneron में Vivarium Operations और Flow Cytometry Core विभागों को भी धन्यवाद देते हैं।
0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
18 gauge needle | BD | 305196 | |
25 gauge needle | BD | 305124 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
BP-1 | BD | 740882 | |
Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
C-Kit | BD | 564011 | |
CD11b | BD | 563168 | |
CD11b | BioLegend | 101222 | |
CD19 | BD | 560143 | |
CD21/35 | BD | 562756 | |
CD23 | BD | 740216 | |
CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
CD3 | BD | 561388 | |
CD3 | BioLegend | 100214 | |
CD43 | BD | 553270 | |
CD43 | BioLegend | 121206 | |
CD5 | BD | 563194 | |
CD93 | BD | 740750 | |
CD93 | BioLegend | 136504 | |
DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
IgD | BioLegend | 405710 | |
IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
Kappa | BD | 550003 | |
Lambda | BioLegend | 407308 | |
paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Ter119 | BioLegend | 116220 | |
True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |