Flow cytometrisk karakterisering av Murine B celleutvikling

Summary

Vi beskriver heri en enkel analyse av heterogeniteten til det murinske immun B-cellerommet i bukhinnen, milten og benmargsvevet ved strømningscytometri. Protokollen kan tilpasses og utvides til andre musevev.

Abstract

Omfattende studier har preget utviklingen og differensiering av murine B-celler i sekundære lymfoide organer. Antistoffer utskilt av B-celler har blitt isolert og utviklet til veletablerte terapeutiske behandlinger. Validering av murine B celleutvikling, i sammenheng med autoimmune utsatte mus, eller hos mus med modifisert immunforsvar, er en avgjørende komponent for å utvikle eller teste terapeutiske midler hos mus og er en passende bruk av strømningscytometri. Veletablerte B-cellestrømcytometriske parametere kan brukes til å evaluere B-celleutvikling i murinperitoneum, benmarg og milt, men en rekke beste praksiser må følges. I tillegg bør strømningscytometrisk analyse av B-cellerom også utfylle ytterligere avlesninger av B-celleutvikling. Data generert ved hjelp av denne teknikken kan fremme vår forståelse av vill type, autoimmune utsatte musemodeller samt humaniserte mus som kan brukes til å generere antistoff- eller antistofflignende molekyler som terapeutiske.

Introduction

Monoklonale antistoffer har i økende grad blitt valgterapi for mange menneskelige sykdommer når de blir en del av vanlig ^medisin1,2. Vi har tidligere beskrevet genmodifiserte mus som effektivt produserer antistoffer som skjuler fullt menneskelige variable regioner med mus IgH-konstanter3,4. Senest har vi beskrevet genetisk konstruerte mus som produserer antistofflignende molekyler som har distinkt ^{antigenbinding5}. Antistoffer utskilles av B-celler og danner grunnlaget for adaptiv humoral immunitet. Det finnes to forskjellige typer B-celler, B-1 og B-2. Hos pattedyr stammer B-1-celler fra fosterlever og er beriket i slimhinnevev og pleural- og bukhulen etter fødselen, mens B-2 celler stammer fra fosterlever før fødselen og deretter i benmargen (BM). B-2 celler er beriket i sekundære lymfoide organer, inkludert milten og ^blodet6,7,8. I BM begynner B-2 hematopoietiske forfedre å skille seg ut til pro-B-celler ved oppstart av Ig mu heavy chain ^{rearrangement9,10}. Vellykket omorganisering av Ig tung kjede og dens montering i pre-B celle reseptoren (pre-BCR), sammen med signalering og proliferativ ekspansjon, fører til differensiering til pre-B celler. Etter at før-B-celler omorganiserer Ig kappa (Igκ), eller hvis uproduktive, Ig lambda (Igλ) lyskjeder, parrer de seg med μ tunge kjede, noe som resulterer i overflate IgM BCR-uttrykk. Det er viktig å påpeke at IgM overflateuttrykk er kjent for å bli redusert under forhold med autoreaktivitet, og dermed bidra til selvtoleranse i funksjonelt ikke-responderende eller anergiske ^{B-celler11,12}. Umodne B-celler går deretter inn i et overgangsstadium, hvor de begynner å uttrykke IgD og migrere fra BM til milten. I milten øker IgD-uttrykket ytterligere og cellene modnes til en andre fase av overgangs B-celler, etterfulgt av ferdigstillelse av modningsstatus og utvikling i enten marginal sone (MZ) eller follikulære (Fol) celler13,14,15. Hos voksne mus, i en ikke-syk setting, forblir antall modne B-celler konstant til tross for at 10-20 millioner umodne B-celler genereres daglig i BM. Av disse går bare tre prosent inn i bassenget med modne B-celler. Størrelsen på det perifere B-cellerommet er begrenset av celledød, delvis på grunn av flere faktorer, inkludert selvreaktivitet og ufullstendig modning16,17,18. Flow cytometrisk analyse har blitt mye brukt til å karakterisere og liste opp mange immuncelleunderrom hos mennesker og mus. Mens det er noen likheter mellom menneskelige og murine B cellerom, gjelder denne protokollen bare for analyse av murine B-celler. Denne protokollen ble utviklet med det formål å fenotyping genetisk konstruerte mus, for å avgjøre om genetisk manipulasjon ville endre B-celleutviklingen. Flowcytometri har også vært enormt populært i mange andre applikasjoner, inkludert i måling av celleaktivering, funksjon, spredning, syklusanalyse, DNA-innholdsanalyse, apoptose og cellesortering ^19,20.

Flow cytometri er det valgte verktøyet for å karakterisere ulike lymfocyttrom hos mus og mennesker, inkludert i komplekse organer som milten, BM og blod. På grunn av allment tilgjengelige musespesifikke antistoffreagenser for strømningscytometri, kan denne teknikken brukes til å undersøke ikke bare celleoverflateproteiner, men også intracellulære fosfoproteiner og cytokiner, samt funksjonelle ^{avlesninger21}. Her viser vi hvordan strømningscytometrireagenser kan brukes til å identifisere B-celler undergrupper når de modnes og differensierer i sekundære lymfoidorganer. Etter optimalisering av fargeforhold, prøvehåndtering, riktig instrumentoppsett og datainnsamling, og til slutt dataanalyse, kan en protokoll for omfattende strømningscytometrisk analyse av B-cellerommet hos mus benyttes. En slik omfattende analyse er basert på en tiår gammel nomenklatur utviklet av Hardy og kolleger, hvor utvikling av BM B-2-celler kan deles inn i forskjellige fraksjoner (Fraction) avhengig av deres uttrykk for B220, CD43, BP-1, CD24, IgM og ^IgD22. Hardy et al., viste at B220 ⁺ CD43 BM B-celler kan deles inn i fire delsett (Brøk A-C’) på grunnlag av BP-1 og CD24 (30F1) uttrykk, mens B220 ⁺ CD43^{-(dim to neg)} BM B-celler kan løses i tre delsett (Fraction D-F) basert på differensialuttrykk av IgD og overflate IgM23. Brøk A (pre-pro-B celler) er definert som BP-1^– CD24 (30F1)^–, Brøk B (tidlige pro-B-celler) er definert som BP-1^– CD24 (30F1)⁺, Brøk C (sen pro-B-celler) defineres som BP-1⁺ CD24 (30F1)⁺, og Brøk C’ (tidlige for-B-celler) defineres som BP-1⁺ og CD24high. Videre er Brøk D (pre-B-celler) definert som B220⁺ CD43^– IgM^{– B-celler}, og Brøk E (nylig genererte B-celler, kombinasjon av umodne og overgangsceller) er definert som B220⁺ CD43^– IgM ⁺ B-celler og Brøk F (modne, resirkulerende B-celler) defineres som B220high CD43^– IgM ⁺ B-celler. Derimot kan de fleste naive B-celler som finnes i milten deles inn i modne (B220⁺ CD93^{-) B-celler} og overgangsceller (T1, T2, T3), avhengig av uttrykk for CD93, CD23 og IgM. Eldre B-celler kan løses i marginalsone og follikulære delsett basert på uttrykk for IgM og CD21/CD35, og follikulære delsett kan videre deles inn i moden follikulær type I og follikulær type II B celledelsett avhengig av nivået på deres IgM- og IgD-overflateuttrykk24. Disse splenic B cellepopulasjonene uttrykker overveiende Igκ lyskjede. Til slutt har B-1 B cellepopulasjoner, som stammer fra fosterlever og hovedsakelig finnes i bukhinnen og pleuralhulen til voksne mus, blitt beskrevet i litteraturen. Disse peritoneale B-cellene kan skilles fra de tidligere beskrevne B-2 B-cellene ved mangel på CD23-uttrykk. De blir deretter videre delt inn i B-1a eller B-1b populasjoner, med førstnevnte definert av tilstedeværelsen av CD5 og sistnevnte ved ^fravær25. B-1 celle forfedre er rikelig i fosterlever, men finnes ikke i voksen BM. Mens B-1a og B-1b celler stammer fra forskjellige forfedre, frø de både peritoneal og pleural ^hulrom24. I motsetning til B-2 celler er B-1 celler unikt i stand til selvfornyelse og er ansvarlige for produksjon av naturlige IgM-antistoffer.

Defekter i B-celleutvikling kan oppstå i mange tilfeller, inkludert mangler i komponentene i ^BCR26,27, perturbasjoner av signalmolekyler som påvirker BCR-signalstyrke14,28,29, eller forstyrrelse av cytokiner som modulerer B-celleoverlevelse30,31 . Flow cytometrianalyse av lymfoidrommene har bidratt til karakteriseringen av B-celleutviklingsblokkene i disse musene og mange andre. En fordel med strømningscytometrisk analyse av lymfoide rom er at den gir muligheten til å gjøre målinger på individuelle celler oppnådd fra levende dissosiert vev. Tilgjengeligheten av reagenser i et stadig voksende utvalg av fluoroforer muliggjør samtidig analyse av flere parametere og muliggjør vurdering av B-celle heterogenitet. Videre kompletterer opplisting av B-celler ved strømningscytometrisk analyse andre immunologiske analyser som immunhiistokjemiske metoder som visualiserer cellelokalisering innen lymfoide organer, påvisning av sirkulerende antistoffnivåer som et mål på humoral immunitet, samt to fotonmikroskopi for å måle B-celleresponser i det virkelige rom og ^tid32.

Protocol

Alle musestudier ble overvåket og godkjent av Regeneron’s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Eksperimentet ble utført på vev fra tre C57BL/6J kvinnelige mus (17 ukers alder) fra Jackson Laboratories. Titrate alle antistoffer før du starter eksperimentet for å bestemme ideell konsentrasjon. Når du bruker kompensasjonsperler for enfarget kompensasjon, må du sørge for at de flekker like lyse eller lysere enn prøvene dine. Hold alle buffere, antistoffer og celler på is eller ved 4 °C. Etter tils…

Representative Results

Her presenterer vi gating strategien for karakterisering B celle utvikling i musen peritoneum, BM og milt. Grunnlaget for analysen er dannet rundt begrepet farging med levedyktighetsfargestoff, og deretter gating ut dobler basert på Forward-Scatter-Area (FSC-A) og Forward-Scatter-Height (FSC-H), og til slutt gating ut rusk ved å velge celler i henhold til deres FSC-A og Side-Scatter-Area (SSC-A) egenskaper, referert til her som størrelsesporten, som reflekterer relativ cellestørrelse …

Discussion

Flow cytometrisk analyse av lymfoide og ikke-lymfoide vev har muliggjort samtidig identifisering og opplisting av B-celleunderpopulasjoner hos mus og mennesker siden 1980-tallet. Den har blitt brukt som et mål på humoristisk immunitet og kan brukes videre for å evaluere B-cellefunksjonalitet. Denne metoden utnytter reagenstilgjengelighet for å vurdere ulike stadier av B-cellemodning hos mus og mennesker, ved hjelp av samtidig analyse av flere parametere som muliggjør vurdering av B-celle heterogenitet, selv i sjeldn…

Materials

0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes	Eppendorf	22363611	0.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes	Corning	352097	15 mL conical tube
18 gauge needle	BD	305196
25 gauge needle	BD	305124
3 mL syringe	BD	309657
70 mM MACS SmartStrainer	Miltenyi Biotec	130-110-916	70 mM cell strainer
96 well U bottom plate	VWR	10861-564
ACK lysis buffer	GIBCO	A1049201	red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate	Pall Corporation	8027	filter plate
B220	eBiosciences	17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ	BD	552843	compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ	BD	552844	compensation beads
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8577	BSA
BP-1	BD	740882
Brilliant Stain Buffer	BD	566349	brilliant stain buffer
C-Kit	BD	564011
CD11b	BD	563168
CD11b	BioLegend	101222
CD19	BD	560143
CD21/35	BD	562756
CD23	BD	740216
CD24 (HSA)	BioLegend	138504
CD3	BD	561388
CD3	BioLegend	100214
CD43	BD	553270
CD43	BioLegend	121206
CD5	BD	563194
CD93	BD	740750
CD93	BioLegend	136504
DPBS (1x)	ThermoFisher	14190-144	DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506	ThermoFisher	65-0866-14	viability dye
Extended Fine Tip Transfer Pipette	Samco	233	disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometer	BD	custom order	flow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)	BD	553142	Fc block
FlowJo	Flowjo		flow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-096-334	automated dissociation tube
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-095-937	tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G)	BioLegend	108422
IgD	BioLegend	405710
IgM	eBiosciences	25-5790-82
Kappa	BD	550003
Lambda	BioLegend	407308
paraformaldehyde, 32% Solution	Electron Microscopy Sciences	15714
Ter119	BioLegend	116220
True-Stain Monocyte Blocker	BioLegend	426103	monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0	ThermoFisher	15575038	EDTA
Vi-CELL XR	Beckman Coulter	731050	cell counter instrument