Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas
Summary
Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.
Abstract
Estudos extensivos caracterizaram o desenvolvimento e diferenciação de células murinas B em órgãos linfoides secundários. Anticorpos secretados por células B foram isolados e desenvolvidos em terapêutica bem estabelecida. A validação do desenvolvimento de células murinas B, no contexto de camundongos propensos a autoimunes, ou em camundongos com sistemas imunológicos modificados, é um componente crucial para desenvolver ou testar agentes terapêuticos em camundongos e é um uso apropriado da citometria de fluxo. Parâmetros citométricos de fluxo celular B bem estabelecidos podem ser usados para avaliar o desenvolvimento de células B no peritônio murina, medula óssea e baço, mas uma série de melhores práticas devem ser aderidas. Além disso, a análise citométrica de fluxo dos compartimentos de células B também deve complementar leituras adicionais do desenvolvimento de células B. Os dados gerados usando essa técnica podem promover nossa compreensão de modelos de camundongos propensos a doenças, autoimunes, bem como camundongos humanizados que podem ser usados para gerar anticorpos ou moléculas semelhantes a anticorpos como terapêuticas.
Introduction
Os anticorpos monoclonais têm se tornado cada vez mais a terapia de escolha para muitas doenças humanas à medida que se tornam parte da medicina convencional1,2. Descrevemos anteriormente camundongos geneticamente modificados que produzem anticorpos de forma eficiente abrigando regiões variáveis totalmente humanas com constantes de IgH de camundongos3,4. Mais recentemente, descrevemos camundongos geneticamente modificados que produzem moléculas semelhantes a anticorpos que têm antígeno-vinculativos distintos5. Anticorpos são secretados por células B e formam a base da imunidade humorativa adaptativa. Existem dois tipos distintos de células B, B-1 e B-2. Em mamíferos, as células B-1 originam-se no fígado fetal e são enriquecidas em tecidos mucosas e nas cavidades pleural e peritoneal após o nascimento, enquanto as células B-2 se originam no fígado fetal antes do nascimento e posteriormente na medula óssea (MMO). As células B-2 são enriquecidas em órgãos linfoides secundários, incluindo o baço e o sangue 6,7,8. No BM, progenitores hematopoiéticos B-2 começam a se diferenciar para células pró-B após o início do rearranjo da cadeia pesada Ig mu9,10. O rearranjo bem sucedido da cadeia pesada de Ig e sua montagem no receptor de células pré-B (pré-BCR), juntamente com sinalização e expansão proliferativa, leva à diferenciação das células pré-B. Depois que as células pré-B reorganizam suas cadeias leves Ig kappa (Igκ), ou se improdutivas, Ig lambda (Igλ), elas combinam com μ corrente pesada, resultando na expressão IgM BCR superficial. É importante ressaltar que a expressão superficial IgM é conhecida por ser reduzida em condições de autoreatividade, contribuindo assim para a auto tolerância em células B funcionalmente não respondidas ou argicasas11,12. As células B imaturas então entram em um estágio de transição, onde começam a co-expressar IgD e migram do BM para o baço. No baço, a expressão igD aumenta ainda mais e as células amadurecem em um segundo estágio de células B transitórias, seguidas pela conclusão de seu status de maturação e desenvolvimento em células de zona marginal (MZ) ou folicular (Fol)13,14,15. Em camundongos adultos, em um ambiente não doente, o número de células B maduras permanece constante, apesar de 10-20 milhões de células B imaturas serem geradas diariamente no BM. Destes, apenas 3% entram no pool de células B maduras. O tamanho do compartimento celular B periférico é limitado pela morte celular, devido em parte a vários fatores, incluindo auto-reatividade e maturação incompleta16,17,18. A análise citométrica de fluxo tem sido amplamente usada para caracterizar e enumerar muitos subcompartimentais de células imunes em humanos e camundongos. Embora existam algumas semelhanças entre compartimentos de células B humanas e murinas, este protocolo se aplica apenas à análise de células murinas B. Este protocolo foi desenvolvido com o propósito de fenotipar camundongos geneticamente modificados, para determinar se a manipulação genética alteraria o desenvolvimento de células B. A citometria de fluxo também tem sido extremamente popular em muitas aplicações adicionais, incluindo na medição da ativação celular, função, proliferação, análise de ciclo, análise de conteúdo de DNA, apoptose e classificação celular 19,20.
A citometria de fluxo é a ferramenta escolhida para caracterizar vários compartimentos de linfócitos em camundongos e humanos, inclusive em órgãos complexos como o baço, BM e sangue. Devido a reagentes de anticorpos específicos do rato amplamente disponíveis para citometria de fluxo, esta técnica pode ser usada para investigar não apenas proteínas da superfície celular, mas também fosfoproteínas intracelulares e citocinas, bem como leituras funcionais21. Aqui demonstramos como reagentes de citometria de fluxo podem ser usados para identificar subconjuntos de células B à medida que amadurecem e diferenciam em órgãos linfoides secundários. Após a otimização das condições de coloração, manuseio de amostras, configuração correta do instrumento e aquisição de dados e, finalmente, análise de dados, um protocolo para análise citométrica de fluxo abrangente do compartimento celular B em camundongos pode ser utilizado. Tal análise abrangente baseia-se em uma nomenclatura de décadas concebida por Hardy e colegas, onde o desenvolvimento de células BM B-2 pode ser dividido em diferentes frações (Fração) dependendo de sua expressão de B220, CD43, BP-1, CD24, IgM e IgD22. Hardy et al., mostraram que as células B220+ CD43 BM B podem ser subdivididas em quatro subconjuntos (Fração A-C’) com base na expressão BP-1 e CD24 (30F1), enquanto as células B220+ CD43-(dim to neg) BM B podem ser resolvidas em três subconjuntos (Fração D-F) com base na expressão diferencial de IgD e IgM23 de superfície. A fração A (células pré-pró-B) são definidas como BP-1– CD24 (30F1)–, A fração B (células pro-B precoces) são definidas como BP-1– CD24 (30F1)+, Fração C (células pro-B tardias) são definidas como BP-1+ CD24 (30F1)+, e Fração C’ (células pré-B precoces) são definidas como BP-1+ e CD24nenta. Além disso, as células Fração D (pré-B) são definidas como células B220+ CD43-IgM-B e Fração E (células B recém-geradas, combinação de imaturo e transitório) são definidas como células B220+ CD43– IgM+ B e Fraction F (células B maduras e recircuturas) são definidas como células B220high CD43– IgM+ B. Em contraste, a maioria das células B ingênuas encontradas no baço pode ser dividida em células B maduras (B220+ CD93–) e células transitórias (T1, T2, T3) dependendo da expressão de CÉLULAS CD93, CD23 e IgM. Células B maduras podem ser resolvidas em subconjuntos marginais e foliculares baseados na expressão de IgM e CD21/CD35, e subconjuntos foliculares podem ser ainda divididos em subconjuntos de células foliculares maduras tipo I e folicular tipo II B, dependendo do nível de sua expressão de superfície IgM e IgD24. Essas populações de células B esplênicas expressam predominantemente cadeia de luz Igκ. Finalmente, as populações de células B-1 B, que se originam no fígado fetal e são encontradas principalmente nas cavidades peritoneal e pleural de camundongos adultos, foram descritas na literatura. Estas células B peritoneal podem ser distinguidas das células B-2 B descritas anteriormente pela falta de expressão CD23. Eles são então subdivididos em populações B-1a ou B-1b, com o primeiro definido pela presença de CD5 e o segundo por sua ausência25. Progenitores de células B-1 são abundantes no fígado fetal, mas não são encontrados em BM adulto. Enquanto as células B-1a e B-1b são originárias de diferentes progenitores, ambas semearam as cavidades peritoneal e pleural24. Em contraste com as células B-2, as células B-1 são exclusivamente capazes de auto-renovação e são responsáveis pela produção de anticorpos IgM naturais.
Defeitos no desenvolvimento celular B podem surgir em muitos casos, incluindo deficiências nos componentes do BCR26,27, perturbações de moléculas de sinalização que impactam a força de sinalização BCR14,28,29, ou interrupção de citocinas que modulam a sobrevivência celular B30,31 . A análise da citometria de fluxo dos compartimentos linfoides contribuiu para a caracterização dos blocos de desenvolvimento de células B nesses camundongos e muitos outros. Uma vantagem da análise citométrica de fluxo dos compartimentos linfoides é que ele oferece a capacidade de fazer medições em células individuais obtidas a partir de tecido dissociado vivo. A disponibilidade de reagentes em uma gama cada vez maior de fluoroforos permite a análise simultânea de múltiplos parâmetros e permite a avaliação da heterogeneidade celular B. Além disso, a enumeração das células B por análise citométrica de fluxo complementa outros ensaios imunológicos, como métodos imunohistoquímicos que visualizam a localização celular dentro de órgãos linfoides, detecção de níveis de anticorpos circulantes como medida de imunidade humoral, bem como duas microscopia fótons para medir as respostas das células B no espaço real e no tempo32.
Protocol
Representative Results
Discussion
A análise citométrica do fluxo de tecidos linfoides e não linfoides permitiu a identificação e enumeração simultânea de sub-populações de células B em camundongos e humanos desde a década de 1980. Tem sido usado como uma medida de imunidade humoral e pode ser aplicado ainda mais para avaliar a funcionalidade de células B. Este método aproveita a disponibilidade de reagentes para avaliar diferentes estágios de maturação celular B em camundongos e humanos, por meio da análise simultânea de múltiplos par…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos matthew Sleeman pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também aos departamentos do Vivarium Operations and Flow Cytometry Core da Regeneron por apoiarem esta pesquisa.
Materials
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
Riferimenti
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