Vi beskriver häri en enkel analys av heterogeniteten hos murin immun B cell facket i bukhinnan, mjälte och benmärg vävnader genom flöde cytometry. Protokollet kan anpassas och utvidgas till andra musvävnader.
Omfattande studier har kännetecknat utveckling och differentiering av murin B-celler i sekundära lymfoida organ. Antikroppar som utsöndras av B-celler har isolerats och utvecklats till väletablerade terapier. Validering av murin B-cellutveckling, i samband med autoimmuna benägen möss, eller hos möss med modifierat immunsystem, är en avgörande komponent för att utveckla eller testa terapeutiska medel hos möss och är en lämplig användning av flödescytometri. Väletablerade B-cellflöde cytometriska parametrar kan användas för att utvärdera B-cellutveckling i murin bukhinnan, benmärgen och mjälten, men ett antal bästa metoder måste följas. Dessutom bör flödescytometrisk analys av B-cellfack också komplettera ytterligare avläsningar av B-cellutveckling. Data som genereras med denna teknik kan främja vår förståelse av vilda typer, autoimmuna benägen musmodeller samt humaniserade möss som kan användas för att generera antikropps- eller antikroppsliknande molekyler som terapier.
Monoklonala antikroppar har i allt högre grad blivit valterapi för många mänskliga sjukdomar när de blir en del av mainstreammedicin1,2. Vi har tidigare beskrivit genetiskt konstruerade möss som effektivt producerar antikroppar som hyser helt mänskliga variabla regioner med mus IgH konstanter3,4. Senast har vi beskrivit genetiskt modifierade möss som producerar antikroppsliknande molekyler som har distinkt antigenbindning5. Antikroppar utsöndras av B-celler och utgör grunden för adaptiv humoral immunitet. Det finns två distinkta typer av B-celler, B-1 och B-2. Hos däggdjur har B-1 celler sitt ursprung i fostrets lever och berikas i slemhinnan vävnader och pleura- och peritonealhåligheterna efter födseln, medan B-2-celler har sitt ursprung i fostrets lever före födseln och därefter i benmärgen (BM). B-2 celler berikas i sekundära lymfoida organ inklusive mjälte och blod6,7,8. I BM börjar B-2 hematopoetiska stamceller differentiera till pro-B-celler vid inledandet av Ig mu tung kedja omorganisering9,10. Framgångsrik omorganisering av Ig tung kedja och dess sammansättning i pre-B cell receptorn (pre-BCR), tillsammans med signalering och proliferative expansion, leder till differentiering till pre-B celler. Efter pre-B celler omorganisera sin Ig kappa (Igκ), eller om improduktiva, Ig lambda (Igλ) ljuskedjor, de paras med μ tung kedja, vilket resulterar i yta IgM BCR uttryck. Det är viktigt att påpeka att IgM ytuttryck är känt för att minskas under förhållanden av autoreaktivitet, vilket bidrar till självtolerans i funktionellt svarslösa eller anergiska B-celler11,12. Omogna B-celler går sedan in i ett övergångsstadium, där de börjar uttrycka IgD och migrera från BM till mjälten. I mjälten ökar IgD-uttrycket ytterligare och cellerna mognar till ett andra steg av övergångs B-celler, följt av slutförande av deras mognadsstatus och utveckling till antingen marginella zoner (MZ) eller follikulära (Fol) celler13,14,15. Hos vuxna möss, i en icke-sjuk miljö, förblir antalet mogna B-celler konstant trots att 10-20 miljoner omogna B-celler genereras dagligen i BM. Av dessa kommer endast tre procent in i poolen med mogna B-celler. Storleken på det perifera B-cellfacket begränsas av celldöd, delvis på grund av flera faktorer, inklusive självreaktivitet och ofullständig mognad16,17,18. Flödescytometrisk analys har använts i stor utsträckning för att karakterisera och räkna upp många immuncellsunderfack hos människor och möss. Även om det finns vissa likheter mellan mänskliga och murin B cell fack, detta protokoll gäller endast analys av murin B celler. Detta protokoll utvecklades i syfte att fenotypning genetiskt konstruerade möss, för att avgöra om genetisk manipulation skulle förändra B-cellutveckling. Flödescytometri har också varit enormt populärt i många ytterligare tillämpningar, bland annat vid mätning av cellaktivering, funktion, spridning, cykelanalys, DNA-innehållsanalys, apoptos och cellsortering 19,20.
Flödescytometri är det verktyg som valts för att karakterisera olika lymfocytfack hos möss och människor, inklusive i komplexa organ som mjälte, BM och blod. På grund av allmänt tillgängliga musspecifika antikroppsreagenser för flödescytometri kan denna teknik användas för att undersöka inte bara cellytans proteiner utan också intracellulära fosfoproteiner och cytokiner, liksom funktionella avläsningar21. Häri visar vi hur flöde cytometri reagenser kan användas för att identifiera B-celler undergrupper som de mognar och differentierar i sekundära lymfoida organ. Efter optimering av färgningsförhållanden, provhantering, korrekt instrumentuppsättning och datainsamling, och slutligen dataanalys, kan ett protokoll för omfattande flödescytometrisk analys av B-cellutrymmet hos möss användas. En sådan omfattande analys är baserad på en årtionden gammal nomenklatur som utarbetats av Hardy och kollegor, där utveckling av BM B-2-celler kan delas in i olika fraktioner (Fraktion) beroende på deras uttryck av B220, CD43, BP-1, CD24, IgM och IgD22. Hardy et al., visade att B220 + CD43 BM B celler kan delas in i fyra delmängder (Fraktion A-C’) på grundval av BP-1 och CD24 (30F1) uttryck, medan B220 + CD43-(dim till neg) BM B celler kan lösas i tre delmängder (Fraktion D-F) baserat på differentiell uttryck av IgD och ytan IgM23. FraktA B (pre-pro-B-celler) definieras som BP-1– CD24 (30F1)–, Frakt B (tidiga pro-B-celler) definieras som BP-1– CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, och Fraktion C’ (tidiga pre-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, och Fraktion C’ (tidiga pre-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, och Fraktion C’ (tidiga pre-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B-celler) definieras som BP-1+ CD24 (30F1)+, Fraktion C (sena pro-B- Dessutom definieras fraktion D (pre-B-celler) som B220+ CD43– IgM– B-celler, och Fraktion E (nygenererade B-celler, kombination av omogna och övergångsceller) definieras som B220+ CD43- IgM+ B-celler och Fraktion F (mogna, omsända B-celler) definieras som B220high CD43- IgM + B-celler. Däremot kan majoriteten av naiva B-celler som finns i mjälten delas in i mogna (B220+ CD93-) B-celler och övergångsceller (T1, T2, T3) beroende på uttryck av CD93, CD23 och IgM. Mogna B-celler kan lösas i marginell zon och follikulära delmängder baserat på uttryck av IgM och CD21/CD35, och follikulära delmängder kan ytterligare delas in i mogna follikulära typ I och follikulära typ II B cell subsets beroende på nivån på deras IgM och IgD ytan uttryck24. Dessa splenic B cell populationer uttrycker främst Igκ ljus kedja. Slutligen har B-1 B cell populationer, som har sitt ursprung i fetala lever och finns främst i peritoneal och pleura håligheter hos vuxna möss, beskrivits i litteraturen. Dessa peritoneal B celler kan särskiljas från de tidigare beskrivna B-2 B celler genom deras brist på CD23 uttryck. De delas sedan vidare in i B-1a- eller B-1b-populationer, där den förstnämnda definieras av förekomsten av CD5 och den senare genom dess frånvaro25. B-1 cell föregångare är rikliga i fetala levern, men finns inte i vuxna BM. Medan B-1a och B-1b celler härstammar från olika stamceller, de båda frö peritoneal och pleura håligheter24. Till skillnad från B-2-celler är B-1-celler unikt kapabla till självförnyelse och ansvarar för produktion av naturliga IgM-antikroppar.
Defekter i B-cellsutveckling kan uppstå i många fall, inklusive brister i komponenterna i BCR26,27, störningar av signalmolekyler som påverkar BCR-signalstyrkan14,28,29, eller störning av cytokiner som modulerar B-cellsöverlevnad30,31 . Flöde cytometri analys av lymfoida fack har bidragit till karakteriseringen av B-cells utvecklingsblocken i dessa möss och många andra. En fördel med flödescytometrisk analys av lymfoida fack är att det erbjuder förmågan att göra mätningar på enskilda celler som erhållits från levande dissocierad vävnad. Tillgången till reagenser i ett ständigt växande utbud av fluoroforer möjliggör samtidig analys av flera parametrar och möjliggör bedömning av B-cells heterogenitet. Dessutom kompletterar uppräkning av B-celler genom flödescytometrisk analys andra immunologiska analyser såsom immunohistokemiska metoder som visualiserar celllokalisering inom lymfoida organ, detektion av cirkulerande antikroppsnivåer som ett mått på humoral immunitet, samt två fotonmikroskopi för att mäta B-cellssvar i verkliga rymden och tiden32.
Flöde cytometrisk analys av lymfoida och icke-lymfoida vävnader har möjliggjort samtidig identifiering och uppräkning av B-cellsunderpopulationer hos möss och människor sedan 1980-talet. Det har använts som ett mått på humoral immunitet och kan tillämpas ytterligare för att utvärdera B-cellsfunktionalitet. Denna metod utnyttjar reagenstillgänglighet för att bedöma olika stadier av B-cellmognad hos möss och människor, genom samtidig analys av flera parametrar som möjliggör bedömning av B-cells heteroge…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Matthew Sleeman för kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar också vivariumoperations- och flödescytometrikärnavdelningarna på Regeneron för att de stöder denna forskning.
0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
18 gauge needle | BD | 305196 | |
25 gauge needle | BD | 305124 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
BP-1 | BD | 740882 | |
Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
C-Kit | BD | 564011 | |
CD11b | BD | 563168 | |
CD11b | BioLegend | 101222 | |
CD19 | BD | 560143 | |
CD21/35 | BD | 562756 | |
CD23 | BD | 740216 | |
CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
CD3 | BD | 561388 | |
CD3 | BioLegend | 100214 | |
CD43 | BD | 553270 | |
CD43 | BioLegend | 121206 | |
CD5 | BD | 563194 | |
CD93 | BD | 740750 | |
CD93 | BioLegend | 136504 | |
DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
IgD | BioLegend | 405710 | |
IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
Kappa | BD | 550003 | |
Lambda | BioLegend | 407308 | |
paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Ter119 | BioLegend | 116220 | |
True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |