Denne protokol beskriver procedurerne for at fremkalde akut nyreskade (AKI) hos voksne zebrafisk ved hjælp af cisplatin som et nefrotoksisk middel. Vi detaljerede trin til at evaluere reproducerbarheden af teknikken og to teknikker til at analysere inflammation og celledød i henholdsvis nyrevævet, flowcytometri og TUNEL.
Cisplatin er almindeligt anvendt som kemoterapi. Selv om det har positive virkninger hos kræftbehandlede personer, cisplatin kan nemt ophobes i nyrerne på grund af sin lave molekylvægt. En sådan akkumulering forårsager dø af rørformede celler og kan fremkalde udviklingen af akut nyreskade (AKI), som er karakteriseret ved et hurtigt fald i nyrefunktion, vævsskader og immunceller infiltration. Hvis cisplatin gives i specifikke doser, kan det være et nyttigt redskab som AKI-inducer i dyremodeller. Zebrafisken har vist sig som en interessant model til at studere nyrefunktion, nyreregenerering og skade, da nyrestrukturer bevarer funktionelle ligheder med pattedyr. Voksne zebrafisk injiceret med cisplatin viser nedsat overlevelse, nyrecelledød og øgede betændelsesmarkører efter 24 timer efter injektion (hpi). I denne model kan immunceller infiltration og celledød vurderes ved flow cytometry og TUNEL assay. Denne protokol beskriver procedurerne for at fremkalde AKI hos voksne zebrafisk ved intraperitoneal cisplatin injektion og viser efterfølgende, hvordan man indsamler nyrevævet til flowcytometribehandling og celledød TUNEL-analyse. Disse teknikker vil være nyttige til at forstå virkningerne af cisplatin som et nefrotoksisk middel og vil bidrage til udvidelsen af AKI-modeller hos voksne zebrafisk. Denne model kan også bruges til at studere nyreregenerering, i søgen efter forbindelser, der behandler eller forhindrer nyreskader og til at studere betændelse i AKI. Desuden vil de metoder, der anvendes i denne protokol, forbedre karakteriseringen af vævsskader og betændelse, som er terapeutiske mål i nyrerelaterede comorbiditeter.
Nyrerne er ansvarlige for flere vigtige fysiologiske funktioner, der opretholder homøostase, såsom blodfiltrering, fjernelse af overskydende rester og regulering af ionkoncentrationer1. Skader på nyrevæv kan føre til en heterogen tilstand kaldet Akut nyreskade (AKI), som klinisk beskrives som et hurtigt fald i nyrefunktion forårsaget af ødelæggelse og død af rørformede epitelceller, endotelcelleskade og leukocyt infiltration 2,3. AKI er en tilstand, der forventes at ske i 8-16% af hospitalsindlæggelser4, med en høj dødelighed, der varierer fra 20 til 50% i intensivafdelingen (ICU)5. Denne lidelse er forbundet med øget hospitalsophold og betydelig brug af økonomiske ressourcer5. Ætologiske faktorer omfatter dehydrering, chok, infektioner, sepsis, hjerte-kar-sygdomme og nefrotoksiske lægemidler6. Nephrotoxicity defineres som en nyreskade forårsaget af stoffer, der forårsager virkninger som AKI, tubulopatier og glomerulopatier7. Nephrotoxicity påvirker to tredjedele af ICU-patienter, da ca. 20% af de lægemidler, der er ordineret på intensivafdelingen, betragtes som nefrotoksiske8,9, dette omfatter nonsteroide antiinflammatoriske lægemidler (NSAID), antibiotika som vancomycin og aminoglycosides og kemoterapeutiske midler som methotrexat og cisplatin7. Cisplatin er en af de mest potente og almindelige kemoterapi lægemidler, der anvendes til behandling af faste tumorer, såsom hoved og hals, testikel, æggestokkene, og blære10. I nyrerne internaliseres cisplatin i det proksimale indviklede rør (PCT) gennem den organiske kationiske transportør 2 (OCT-2) og i høje koncentrationer binder sig til dna-udløser celledødsvejene7,10,11,12. Akkumulering af dette lægemiddel i nyrerne bidrager til nephrototoksicitet med død ogbetændelse 13. Denne skadelige bivirkning påvirker enormt liv og prognose for en tredjedel af kræftpatienter, der gennemgår cisplatinbehandling, så det er bydende nødvendigt at forske i nye terapier, der kan sænke nephrotoxicity uden at miste dræbereffekten på kræftceller10.
På grund af denne nefrotoksiske virkning anvendes cisplatin almindeligvis som en induktor af AKI i eksperimentelle dyremodeller, som beskrevet fremad. Hos gnavere blev den første AKI-model fremkaldt af cisplatin rapporteret i 197114, men på nuværende tidspunkt er der opstået mange forskellige protokoller ved hjælp af de dosisafhængige og kumulative virkninger af cisplatin15. Derved, afhængigt af doseringen og antallet af applikationer, forskellige sværhedsgrader af nyreskade kan induceres16,17,18,19,20,21. Den hyppigste metode består af en intraperitoneal (i.p.) injektion af en dosis cisplatin efterfulgt af aktiv dødshjælp i de følgende dage. I denne klassiske protokol fremkalder en enkelt høj nefrotoksisk dosis cisplatin (10-13 mg/kg hos mus og/eller 3-8 mg/kg hos rotter) alvorlige histologiske ændringer, såsom tab af børstekant og cellerester inde i rørformede lumen, få dage efter cisplatininjektionen. Sværhedsgraden af histologiske ændringer er dosisafhængig, og tegn på regenerering observeres 7 dage efter cisplatin injektion16,17.
Selvom gnavermodeller er veletablerede, besluttede vi at drage fordel af egenskaberne ved et andet hvirveldyr og fokusere vores undersøgelser på zebrafisken (Danio rerio). Denne fisk er blevet flittigt brugt til modellering af menneskelige sygdomme på grund af sin lille størrelse, ekstern befrugtning, høje reproduktionsrater, hurtig udvikling, gennemsigtighed af embryoner og larver, lave vedligeholdelsesomkostninger, lignende anatomi som pattedyr (med nogle undtagelser), høj vævsregenereringskapacitet, social adfærd, 70% af genetisk lighed med mennesker og 84% med menneskelige sygdomme-associerede gener22. Streisinger et al.23,24,25 startede undersøgelserne med zebrafisk, der bekræftede gennemførligheden af at udnytte denne modelorganisme til genetisk analyse af hvirveldyrudvikling. I nyreforskning er zebrafisken opstået ikke kun i udviklingsundersøgelser, men også som et genetisk værktøj i søgen efter nye gener forbundet med nyreforhold26. Desuden gør regenereringskapaciteten uden ardannelse og evnen til at generere nephron gennem deres liv, kaldet neonephrogenese, zebrafisken til en vigtig dyremodel til regenereringsforskning27,28. Desuden viser tilgængeligheden af eksperimentelle modeller for forskellige nyresygdomme, herunder akut og kronisk nyreskade, alsidigheden af denne eksperimentelle organisme26,29. Som hos pattedyr stammer zebrafiskens nyre forfædre fra den mellemliggende mesoderm. Sådanne nyre forfædre genererer de pronephros, der senere vil udvikle sig til mesonephros, som vil blive opretholdt som et modent organ indtil voksenalderen29,30.
Den voksne zebrafisk nyre er placeret på kroppens dorsale væg, mellem svømmeblæren og rygraden29. Fra en ventral visning kan zebrafisken opdeles i tre regioner(figur 1A):hoved (H), bagagerum (Tr) og hale (Ta)29. Samme som pattedyr har zebrafisken nephronerne som funktionelle enheder af nyrerne, som er opdelt i tubulesegmenter (Figur 1A): nyrekorpuskel (RC), proksimal indviklede tubule (PCT), proksimal lige tubule (PST), distal tidligt (DE), sen distal (DL) og opsamlingskanal (CD)29. Zebrafisk deler genetisk bevarelse og strukturelle ligheder med humane nephrons (Figur 1B), men mangler nogle konformationer såsom den mellemliggende tubule, også kendt som løkken af Henle (LH)29,31. Ferskvandsfisk som zebrafisk er normalt omgivet af et medium med meget lav osmolaritet, på grund af dette har de tendens til at være hyperosmotiske og afhænge af gællerne, huden i tidlige stadier og nyrerne til at regulere osmolaritet og vandudsledning32. Filtreringen af blod fra dorsal aorta af tilbøjeligephros begynder omkring 48 timer efter befrugtning (hpf)33,34. Zebrafiskens nyre er ikke kun et metabolisk affaldsudsletningsorgan, men fungerer også som et hæmatopoietisk organ fra 4 dage efter befrugtning (dpf) til voksenalderen, og det svarer til knoglemarven hos pattedyr35. Under udviklingen, hæmatopoietiske stamceller (HSC’ er) vil frø nyrerne, selvrenovere, og generere myeloid, erythroid, og lymfoid celle afstamning, opretholde transskription faktorer, signalering molekyler, og stærkt bevaret genetiske programmer med pattedyr36,37. Undersøgelser har vist, at de fleste erythroid, trombocytiske, myeloide og lymfoide celler i det menneskelige immunsystem er til stede i zebrafisk37,38. De unikke egenskaber ved dette dyr og de bevarede funktioner med den menneskelige nyre gjorde denne modelorganisme fordelagtig i forskningen i nyrefunktion, skade og regenerering.
Selvom zebrafiskens nyre er godt undersøgt, og nogle modeller af AKI allerede er tilgængelige i larve og voksen zebrafisk28, var der på tidspunktet for etableringen af denne protokol ingen tegn på en kemisk induceret ikke-antibiotisk AKI-model hos voksne zebrafisk. Derudover fokuserer vores laboratorium på at teste probiotiske bakterier og mikrobiota-afledte forbindelser for at studere regenerering og nyreskader, og derfor koncentrerede vi vores indsats om at skabe en ny cisplatin-induceret AKI-model i voksne fisk. Den videoartikel, der præsenteres i dette manuskript, demonstrerer procedurerne for en ny model for AKI-induktion ved hjælp af en i.p. injektion på 120 ug cisplatin pr. g dyr (120 μg/g) (Figur 2A). Denne dosis var oprindeligt baseret på undersøgelser af AKI induceret af cisplatin i murinmodeller, der gik omkring 10 mg/kg (svarende til 10 μg/g)14,15,16,17, men denne dosis var ikke tilstrækkelig til at fremkalde nyreskader relateret til nephrotoksicitet (data ikke vist). Således øgede vi dosis til dem, der anvendes i denne undersøgelse (Figur 2B). Vores arbejde afslørede en dosisafhængig effekt af cisplatin i overlevelsesraten efter injektion med induktion af nyrevævsskader 24 hpi som vist ved tab af rørstruktur, øget inflammatorisk infiltrere og høj celledødsfald. Her beskriver vi to teknikker til analyse af udviklingen af cisplatin-induceret AKI: flowcytometry, til at analysere celleinfiltration og TUNEL til måling af celledød. Flowcytometri er en teknologi, der måler cellernes fysiske (størrelse og granularitet) og kemiske (fluorescerende forbindelser). Inde i cytometeret løber celleaffjedringen gennem en kappevæske, der organiserer cellerne i en enkelt linje, så de kan passere gennem en laserstråle en celle ad gangen (Figur 3A). En detektor foran lysstrålen måler FSC (Forward Scatter), som korrelerer med cellestørrelse, og detektorer til siden måler den side scatter (SSC), der korrelerer med cellernes granularitet. Andre detektorer vil måle fluorescensen fra partikler , fluorescerende proteiner eller antistofmærkede celler39,40. Da kommercielle antistoffer mod zebrafisk er knappe i dag, gør brugen af dyrejournalister og fluorescerende biomarkører det muligt at forbedre denne analyse og identificere forskellige cellepopulationer41,42,43. Et andet værktøj, der blev brugt i denne protokol, var TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase) dUTP Nick End Labeling (TUNEL) analyse. TUNEL-analysen er en sen-fase apoptosedetekteringsmetode, der er afhængig af TdT’s evne til at identificere fragmenteret DNA og mærke det med deoxynukleotider mærket med en fluorescerende markør, der senere kan visualiseres og kvantificeres ved mikroskopi44 (Figur 3B). I betragtning af at et af de mest slående træk ved AKI er induktion af apoptose i rørformede nyreceller3, er denne teknik yderst fordelagtig, da den kan analyseres ved flowcytometry og / eller mikroskopi.
Tilgangene i denne artikel gør det muligt at observere AKI-status og tilbyde en ny akut model til undersøgelse af AKI-lidelser, der kan være nyttige til forskning i nye terapeutiske mål i cisplatin-relateret AKI.
Forekomsten af nyresygdom er fortsat med at stige på verdensplan og bliver et globalt folkesundhedsproblem, der påvirker millioner af mennesker63. At finde en måde at behandle nyreskadede personer er af afgørende betydning samt forstå mere om deres ætiologi og progression. Flere undersøgelser har brugt dyremodeller til at forstå nyreskader. Zebrafisk nyre (Figur 1) er blevet undersøgt i årevis i udviklingsbiologi og skade forskning på grund af sin selvregenererende kapacitet og genetiske lighed29,64. Her præsenterer vi en ny AKI-model i voksen zebrafisk ved hjælp af cisplatins egenskaber som et nefrotoksisk middel, der beskriver trinene til at opnå en hurtig og akut reaktion med skader synlige, så snart 24 hpi (Figur 2). Desuden forklarer vi her to teknikker, der vil hjælpe med at evaluere vævsskaden efter cisplatinindsprøjtningen, flowcytometry og TUNEL (Figur 3).
Nuværende AKI-modeller i voksne zebrafisk omfatter i.p. injektion af gentamicin, som fremkalder omfattende skader i nephron og tubule ødelæggelse, neonephrogenesis begivenheder starter fra dag 5, og regenerering er afsluttet med 21 dage efter injektion65. På den anden side blev en model af sepsis-associeret akut nyreskade (S-AKI) etableret ved infektionen med Edwardsiella tarda, da signifikant øgede ekspressionen af AKI-markører, såsom insulinlignende vækstfaktorbindende protein-7 (IGFBP7), vævshæmmer af metalloproteinaser 2 (TIMP-2) og nyreskademolekyle-1 (KIM-1), hos larver og voksne zebrafisk66. Zebrafisken er kendt for at være et dyr med høj gennemstrømning til søgning af terapeutiske midler, og dette omfatter brugen af probiotika og mikrobiota-afledte metabolitter til undersøgelse af nyrefunktion og regenerering67. Men de tilgængelige modeller kan direkte påvirke resultatet af disse behandlinger. Således har vi etableret en anden metode til at fremkalde AKI hos voksne zebrafisk (Figur 4), ved hjælp af cisplatin som et kendt nefrotoksisk middel, der ikke ville have direkte kendte virkninger på fiskens mikrobiota, ligesom gentamicinmodellen for at være et antibiotikum eller infektionen med E. tarda, for at være en sepsismodel. Men samtidig med at vi var ved at udvikle vores cisplatin protokol, en anden gruppe også undersøgt de nefrotoksiske virkninger af cisplatin hos voksne zebrafisk, forenkle dosis til 10-20-30 μg pr dyr68. Selv om de også viste cisplatin dosisafhængig effekt i overlevelse, anbefaler vi forsigtighed ved brug af en enkelt mængde cisplatin til alle fisk, da zebrafisk fra samme alder kan have meget forskellige størrelser og vægt, og dette kan fremkalde variationer i resultaterne69,70. Vi synes er vigtigt at justere dosis til dyrets tilsvarende vægt, som det gøres i mus og denne undersøgelse.
I vores eksperimenter med voksne zebrafisk viste cisplatin en dosisresponseffekt. Dette blev visualiseret ved at overvåge dyrenes overlevelsesrate efter cisplatininjektion (figur 5). Vi brugte overlevelse som en måde at estimere intensiteten af dosis af cisplatin og ikke som et mål for nephrototoksicitet, da intet andet fysisk tegn er synligt i overvågningstiden. Dette kan sammenlignes med gnavere, hvor sværhedsgraden af nyreskaden kan moduleres ved dosering og hyppighed af cisplatin injektion15, opnå dødelige doser med højere koncentrationer af cisplatin71. Døde ses også i de følgende dage i larvemodellen af cisplatin72. Da vores mål var at fremkalde en akut skade på få dage, valgte vi 120 μg/g dosis cisplatin, som det er muligt at observere nyreskader 24 timer efter injektionen, men dette kan justeres afhængigt af undersøgelsens mål.
Hos mennesker diagnosticeres AKI klinisk af nedsat glomerulær filtreringshastighed (GFR), forhøjet serum kreatinin og blod urea nitrogen3. I zebrafisk omfatter repertoiret af AKI-modeller nogle genetisk betingede modeller73,74 og nogle lægemiddelrelaterede modeller65,72, men da nogle af AKI funktionelle parametre ikke kan måles på zebrafisk på grund af tekniske vanskeligheder(f.eks. blodsamling), vedtager de fleste forskning morfologiske og visuelle teknikker til at observere funktionerne i AKI1,75 som vores undersøgelse.
Hos gnavere kommer cisplatin ind i epitelcellerne i de proksimale og distale tubules, inde i cellen gennemgår metabolisk aktivering og bliver meget reaktiv, der virker på celleorganeller og fremkalder ændringer i cellestrukturen. Disse ændringer kan fremkalde apoptose og autofagi og endda nekrose, ved meget høje doser. Som reaktion på denne skade frigives mange cytokiner, og leukocytter rekrutteres, hvilket fører til betændelse og påvirker organets funktionalitet15. Dette fremhæver vigtigheden af at vurdere, hvilken type celler der kan findes i den skadede nyre, som beboere eller infiltrerede immunceller. Her viste vi, hvordan man vurderer dette ved flow cytometry, ved hjælp af transgene immun reporter linjer til rådighed i dag (Tabel 1). Cisplatin øgede procentdelen af neutrofiler (mpo:GFP positive celler) i nyrerne 24 timer efter injektionen (Figur 6). I tilfælde af zebrafisk er nyrerne nichen af HSC’er, der giver anledning til forskellige blodcelletyper. Ikke desto mindre cirkulerer mange granulocytter og makrofager normalt i blodet. I vores eksempel brugte vi den mpo:GFP transgene linje, der udtrykker GFP under promotoren af myeloperoxidase af neutrofiler52. Originale undersøgelser af mpo:GFP transgen linje demonstreret udtryk for myeloperoxidase i forskellige tilstande af neutrofil modning76, men vores gate strategi fokuseret på granulocyte fraktion, der omfatter modne celler, der kommer fra blodet52, på denne måde vores analyse omfatter infiltrerede celler og ikke hjemmehørende celler. Dette er vigtigt at overveje, når man isolerer den ønskede cellepopulation.
Som forklaret ovenfor er apoptose den mest klassiske markør for cisplatin-relateret AKI. Her demonstrerede vi en simpel protokol for lokalisering af døde celler ved TUNEL-analysen. Cisplatin-injektionen øgede antallet af apoptotiske celler 24 hpi (Figur 7). Dette kan let kvantificeres ved at tælle direkte de døde celler fra vævet. Ikke desto mindre kan brugen af antistoffer mod den ønskede celle(f.eks. rørceller) eller brugen af en transgen reporterlinje anvendes sammen med denne teknik til identifikation af cellespecifik død. Sammenlignet med den gentamicin-inducerede model af AKI ser cisplatin ud til at være en mere alvorlig model, da gentamicinapoptose var højere på den tredje dag efter injektion65.
På trods af at have en række bivirkninger, cisplatin er stadig meget udbredt i kræftbehandling, på grund af dens effektivitet mod forskellige typer af kræft, herunder karcinomer, kimcelle tumorer, lymfomer, ogsarkomer 77. Nephrotoxicity forekommer hos en tredjedel af patienterne i behandling med cisplatin10, således er det bydende nødvendigt at søge efter strategier, der kan reducere denne effekt og øge renoprotection. Vi mener, at de metoder og teknikker, der præsenteres i dette manuskript, vil bidrage til at belyse mekanismer til nyreskade og finde terapeutiske mål, der kan være afgørende for at forbedre livskvaliteten for personer, der lider af nyrekomplikationer, overvejende dem, der er relateret til brugen af cisplatin.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), finanskode 001. Vi takker vores samarbejdspartnere på Laboratoriet af Maria Rita dos Santos e Passos-Bueno’s og Zebrafish Facility of the Genetics and Evolutionary Biology Department, i Bioscience Institute ved universitetet i São Paulo. Vi takker Cristiane Naffah de Souza Breda og Theresa Raquel de Oliveira Ramalho for kommentarerne og forslagene til manuskriptet. Vi sætter stor pris på og takker Marcio Villar Martins, fra multimedie-team af Institut for Biomedicinske Videnskaber, for optagelse, udgave og produktion af denne video.
1x PBS | Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water | ||
31 G 1.0 cc insulin syringe | BD Plastipak | 990256 | Needle: BD Precision Glide 300110 |
3.5 L Fish tank | Tecniplast | Part of the aquactic system | |
6 well plate | Corning | 351146 | |
10 mM Tris/HCl | Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000) | ||
50 ml Falcon tube | Corning | 352070 | |
2-3% Agarose | Invitrogen | 16500-500 | Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve. |
2% FBS | Gibco | 12657-09 | Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS |
4% Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C |
50% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
70% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
90% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
100% Ethanol | Synth | 00A1115.01.BJ | |
100% Xylene | Synth | 00X1001.11.BJ | |
Cell strainer 40 µm | Corning | 431750 | |
Cisplatin | Blau Farmacêutica | 16020227 | C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature. |
Cork board sheet | Obtained from local stationary store | ||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Stock solution 20 mg/ml dissolved in water |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Flow cytometry tubes | Corning | 352052 | |
Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
Histology cassette | Ciencor | 2921 | |
Immuno stain chamber | Ciencor | EP-51-05022 | |
Incubator | NAPCO | 5400 | Set to 37 °C |
Insect pins | Papillon | Model micro15x20 | |
In Situ Cell Death Detection Kit | Roche Diagnostics | 12156792910 | |
Metal mold | Leica Biosystems | 3803081 | |
Micropipette 200-1000 µL | Eppendorf | Use 1 mL tips | |
MS-222 (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040-25G | |
NaCl 0.9% | Synth | C1060.01.AG | Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water |
Nail polish | Prefer transparent | ||
Neubauer chamber | Precicolor HGB | ||
Pasteur plastic pipet | United Scientific Supplies | P31201 | |
Paraplast | Sigma-Aldrich | P3558 | |
Petri dish | J.ProLab | 0307-1/6 | 60 and 100 mm |
Plastic spoon | Obtained from local store | ||
Proteinase K | New England BioLabs | P8102 | Diluite from stock 20 mg/ml |
Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Scalpel blade | Solidor | ||
Sponge | Obtained from local store | ||
Trypan Blue | Cromoline | 10621/07 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Cytometer | BD Biosciences | FACSCanto II | |
Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
Fluorescence Microscope | Zeiss | AxioVert.A1 | |
Microtome | Leica | Jung Supercut | |
Scale | Ohaus Corporation | AR2140 |