Denne protokollen beskriver prosedyrene for å indusere akutt nyreskade (AKI) hos voksne sebrafisk ved hjelp av cisplatin som nefrotoksisk middel. Vi detaljerte trinnene for å evaluere reproduserbarheten av teknikken og to teknikker for å analysere betennelse og celledød i henholdsvis nyrevevet, strømningscytometri og TUNEL.
Cisplatin brukes ofte som kjemoterapi. Selv om det har positive effekter hos kreftbehandlede individer, kan cisplatin lett akkumuleres i nyrene på grunn av sin lave molekylvekt. Slik akkumulering forårsaker død av rørformede celler og kan indusere utviklingen av akutt nyreskade (AKI), som er preget av en rask reduksjon i nyrefunksjon, vevsskade og immuncelleinfiltrasjon. Hvis det administreres i bestemte doser, kan cisplatin være et nyttig verktøy som AKI-induser i dyremodeller. Sebrafisken har dukket opp som en interessant modell for å studere nyrefunksjon, nyreregenerering og skade, da nyrestrukturer sparer funksjonelle likheter med pattedyr. Voksen sebrafisk injisert med cisplatin viser redusert overlevelse, nyrecelledød og økte betennelsesmarkører etter 24 timer etter injeksjon (hpi). I denne modellen kan immunceller infiltrasjon og celledød vurderes ved strømningscytometri og TUNEL-analyse. Denne protokollen beskriver prosedyrene for å indusere AKI i voksen sebrafisk ved intraperitoneal cisplatin injeksjon og deretter demonstrerer hvordan å samle nyrevev for strømning cytometri behandling og celle død TUNEL analyse. Disse teknikkene vil være nyttige for å forstå effekten av cisplatin som et nefrotoksisk middel og vil bidra til utvidelse av AKI-modeller i voksen sebrafisk. Denne modellen kan også brukes til å studere nyreregenerering, i søket etter forbindelser som behandler eller forhindrer nyreskade og for å studere betennelse i AKI. Videre vil metodene som brukes i denne protokollen forbedre karakteriseringen av vevsskade og betennelse, som er terapeutiske mål i nyrerelaterte komorbiditeter.
Nyrene er ansvarlige for flere viktige fysiologiske funksjoner som opprettholder homeostase, for eksempel blodfiltrering, fjerning av overflødige rester og regulering av ionkonsentrasjoner1. Skade på nyrevev kan føre til en heterogen tilstand kalt Akutt nyreskade (AKI), som klinisk beskrives som en rask reduksjon i nyrefunksjon forårsaket av ødeleggelse og død av rørformede epitelceller, endotelcelleskade og leukocyttinfiltrasjon 2,3. AKI er en tilstand som forventes å skje i 8-16% av sykehusinnleggelser4, med en høy dødelighet som varierer fra 20 til 50% på intensivavdelingen (intensivavdelingen)5. Denne sykdommen er forbundet med økt sykehusopphold og betydelig bruk av økonomiske ressurser5. Etiologiske faktorer inkluderer dehydrering, sjokk, infeksjoner, sepsis, kardiovaskulær sykdom og nefrotoksiske legemidler6. Nefrotoksisitet er definert som en nyreskade indusert av narkotika, forårsaker effekter som AKI, tubulopatier og glomerulopatier7. Nefrotoksisitet påvirker to tredjedeler av intensivpasienter, da omtrent 20% av legemidlene som er foreskrevet på intensivavdelingen, regnes som nefrotoksiske8,9, dette inkluderer ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAIDs), antibiotika som vancomycin og aminoglykosider, og kjemoterapeutiske midler som metotreksat og cisplatin7. Cisplatin er et av de mest potente og vanlige kjemoterapimedisinene, som brukes til behandling av faste svulster, som hode og nakke, testikkel, eggstokk og blære10. I nyrene internaliseres cisplatin i det proksimale konvoluterte røret (PCT) gjennom den organiske kationiske transportøren 2 (OCT-2) og i høye konsentrasjoner binder seg til DNA-utløsende celledødsveier7,10,11,12. Akkumuleringen av dette stoffet i nyrene bidrar til nefrotoksisitet med død og betennelse13. Denne skadelige bivirkningen påvirker enormt livet og prognosen til en tredjedel av kreftpasienter som gjennomgår cisplatinbehandling, så det er viktig forskningen på nye terapier som kan senke nefrotoksisiteten uten å miste drapseffekten på kreftceller10.
På grunn av denne nefrotoksiske effekten brukes cisplatin ofte som en induktor av AKI i eksperimentelle dyremodeller, som beskrevet fremover. Hos gnagere ble den første AKI-modellen indusert av cisplatin rapportert i 197114, men for tiden har mange forskjellige protokoller dukket opp ved hjelp av de doseavhengige og kumulative effektene av cisplatin15. Dermed, avhengig av dosering og antall applikasjoner, kan forskjellige karakterer av alvorlighetsgraden av nyreskade induseres16,17,18,19,20,21. Den hyppigste metoden består av en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av en dose cisplatin etterfulgt av eutanasi i de følgende dagene. I denne klassiske protokollen induserer en enkelt høy nefrotoksisk dose cisplatin (10-13 mg/kg hos mus og/eller 3-8 mg/kg hos rotter) alvorlige histologiske endringer, som tap av børstekant og celleavfall inne i den rørformede lumen, noen dager etter cisplatinininjeksjon. Alvorlighetsgraden av histologiske endringer er doseavhengig, og tegn på regenerering observeres 7 dager etter cisplatin injeksjon16,17.
Selv om gnagermodeller er godt etablert, bestemte vi oss for å dra nytte av egenskapene til en annen virveldyr, med fokus på sebrafisken (Danio rerio). Denne fisken har blitt mye brukt til modellering av menneskelige sykdommer, på grunn av sin lille størrelse, ekstern befruktning, høye reproduksjonshastigheter, rask utvikling, gjennomsiktighet av embryoer og larver, lav vedlikeholdskostnad, lignende anatomi som pattedyr (med noen unntak), høy vevsregenereringskapasitet, sosial atferd, 70% genetisk likhet med mennesker og 84% med menneskelige sykdommer-assosierte gener22. Streisinger et al.23,24,25 startet studiene med sebrafisk som bekreftet praktiseringen av å bruke denne modellorganismen for genetisk analyse av virveldyrutvikling. I nyreforskning har sebrafisken dukket opp ikke bare i utviklingsstudier, men også som et genetisk verktøy i søket etter nye gener knyttet til nyreforhold26. Videre gjør regenereringskapasiteten uten arrdannelse og evnen til å generere nefroner gjennom livet, kalt neonephrogenesis, sebrafisken til en nøkkeldyrmodell for regenereringsforskning27,28. Videre viser tilgjengeligheten av eksperimentelle modeller for forskjellig nyresykdom, inkludert akutt og kronisk nyreskade, allsidigheten til denne eksperimentelle organismen26,29. Som hos pattedyr, er renal forfedre av sebrafisken avledet fra mellomliggende mesoderm. Slike nyregenitorer genererer de utsattephros som senere vil utvikle seg til mesonephros, som vil bli opprettholdt som et modent organ til voksen alder29,30.
Den voksne sebrafisk nyre ligger på kroppens dorsale vegg, mellom svømmeblæren og ryggraden29. Fra ventral visning kan sebrafisken segmenteres i tre regioner (Figur 1A): hode (H), bagasjerom (Tr) og hale (Ta)29. Samme som pattedyr, har sebrafisken nephrons som funksjonelle enheter av nyrene, som er delt inn i tubule segmenter (Figur 1A): nyrekorpuskel (RC), proksimal konvolutert tubule (PCT), proksimal rett tubule (PST), distal tidlig (DE), sen distal (DL) og samle kanal (CD)29. Sebrafisk deler genetisk bevaring og strukturelle likheter med menneskelige nephrons (Figur 1B), men mangler noen konformasjoner som mellomliggende tubule, også kjent som løkken til Henle (LH)29,31. Ferskvannsfisk som sebrafisk er normalt omgitt av et medium med svært lav osmolaritet, på grunn av dette har de en tendens til å være hyperosmotiske og avhenger av gjellene, huden i tidlige stadier og nyrene for å regulere osmolaritet og vannutskillelse32. Filtreringen av blod fra dorsal aorta av pronephros begynner rundt 48 h etter befruktning (hpf)33,34. Nyrene i sebrafisken er ikke bare et metabolsk avfallsutskillelsesorgan, men fungerer også som et hematopoietisk organ fra 4 dager etter befruktning (dpf) til voksen alder, og det tilsvarer benmargen hos pattedyr35. Under utviklingen vil hematopoietiske stamceller (HSC) frø nyrene, selvrenovere og generere myeloid, erythroid og lymfoide celleavstamninger, opprettholde transkripsjonsfaktorer, signalmolekyler og høyt bevarte genetiske programmer med pattedyr36,37. Studier har avslørt at de fleste erythroid, trombocytiske, myeloide og lymfoide celler i det menneskelige immunsystemet er til stede i sebrafisk37,38. De unike egenskapene til dette dyret og de konserverte egenskapene med den menneskelige nyre gjorde denne modellorganismen fordelaktig i forskningen på nyrefunksjon, skade og regenerering.
Selv om zebrafiskens nyre er godt studert og noen modeller av AKI allerede er tilgjengelige i larve og voksen sebrafisk28, på tidspunktet for etableringen av denne protokollen var det ingen bevis for en kjemisk indusert ikke-antibiotika AKI-modell i voksen sebrafisk. Foruten dette fokuserer laboratoriet vårt på å teste probiotiske bakterier og mikrobiota-avledede forbindelser for å studere regenerering og nyreskade, og dermed konsentrerte vi vår innsats for å skape en ny cisplatin-indusert AKI-modell hos voksne fisk. Videoartikkelen som presenteres i dette manuskriptet demonstrerer prosedyrene for en ny modell av AKI-induksjon ved hjelp av en i.p. injeksjon av 120 ug cisplatin per g dyr (120 μg/g) (Figur 2A). Denne dosen var opprinnelig basert på studier av AKI indusert av cisplatin i murinmodeller som gikk rundt 10 mg / kg (tilsvarende 10 μg / g)14,15,16,17, men denne dosen var ikke tilstrekkelig til å indusere nyreskade relatert til nefrotoksisitet (data ikke vist). Dermed økte vi dosen til de som ble brukt i denne studien (Figur 2B). Vårt arbeid avdekket en doseavhengig effekt av cisplatin i overlevelsesrate etter injeksjon med induksjon av nyrevevsskade 24 hpi som vist ved tap av rørformet struktur, økt inflammatorisk infiltrat og høy grad av celledød. Her beskriver vi to teknikker for å analysere utviklingen av cisplatin-indusert AKI: flowcytometri, for å analysere celleinfiltrasjon og TUNEL, for å måle celledød. Flow cytometri er en teknologi som måler de fysiske (størrelse og granularitet) og kjemiske (fluorescerende forbindelser) egenskaper av cellene. Inne i cytometeret går cellefjæringen gjennom en kappevæske som organiserer cellene i en enkelt linje, slik at de kan passere gjennom en laserstråle en celle om gangen (Figur 3A). En detektor foran lysstrålen vil måle Forward Scatter (FSC), som korrelerer med cellestørrelsen, og detektorer til siden vil måle sidespredningen (SSC) som korrelerer med cellenes granularitet. Andre detektorer vil måle fluorescensen fra partikler, fluorescerende proteiner eller antistoffmerkede celler39,40. Ettersom kommersielle antistoffer for sebrafisk er knappe i dag, gjør bruk av dyrereportere og fluorescerende biomarkører det mulig å forbedre denne analysen og identifisere forskjellige cellepopulasjoner41,42,43. Et annet verktøy som ble brukt i denne protokollen var Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick End Labeling (TUNEL) analyse. TUNEL-analysen er en senfase apoptosedeteksjonsmetode som er avhengig av TdTs evne til å identifisere fragmentert DNA og merke det med deoksynukleotider merket med en fluorescerende markør som senere kan visualiseres og kvantifiseres ved mikroskopi44 (figur 3B). Tatt i betraktning at en av de mest slående egenskapene til AKI er induksjon av apoptose i rørformede nyreceller3, er denne teknikken ekstremt fordelaktig siden den kan analyseres ved strømningscytometri og / eller mikroskopi.
Tilnærmingene som presenteres i denne artikkelen tillater observasjon av AKI-statusen og tilbyr en ny akutt modell for å studere AKI-lidelser som kan være nyttige for forskning av nye terapeutiske mål i cisplatin-relatert AKI.
Utbredelsen av nyresykdom har fortsatt å øke over hele verden, og blir et globalt folkehelseproblem som rammer millioner av mennesker63. Å finne en måte å behandle nyre skadede individer er av avgjørende betydning, så vel som å forstå mer om deres etiologi og progresjon. Flere studier har brukt dyremodeller for å forstå nyreskader. Sebrafisk nyre (Figur 1) har blitt studert i årevis i utviklingsbiologi og skadeforskning på grunn av sin selvregenererende kapasitet og genetiske likhet29,64. Her presenterer vi en ny AKI-modell i voksen sebrafisk ved hjelp av egenskapene til cisplatin som nefrotoksisk middel, som beskriver trinnene for å oppnå en rask og akutt reaksjon med skade synlig så snart 24 hpi (Figur 2). Videre forklarer vi her to teknikker som vil bidra til evaluering av vevsskaden etter cisplatinin-injeksjonen, strømningscytometri og TUNEL (figur 3).
Nåværende AKI-modeller i voksen sebrafisk inkluderer i.p. injeksjon av gentamicin som induserer omfattende skade i nephron og tubule ødeleggelse, neonephrogenesis hendelser starter fra dag 5, og regenerering er fullført med 21 dager etter injeksjon65. På den annen side ble en modell av sepsis-assosiert akutt nyreskade (S-AKI) etablert av infeksjonen med Edwardsiella tarda, siden betydelig økt uttrykket av AKI-markører, som insulinlignende vekstfaktorbindende protein-7 (IGFBP7), vevshemmer av metalloproteinaser 2 (TIMP-2) og nyreskademolekyl-1 (KIM-1), i larver og voksen sebrafisk6. Sebrafisken er kjent for å være et høygjennomstrømningsdyr for søking av terapeutiske midler, og dette inkluderer bruk av probiotika og mikrobiota-avledede metabolitter for å studere nyrefunksjon og regenerering67. De tilgjengelige modellene kan imidlertid direkte påvirke utfallet av disse behandlingene. Dermed etablerte vi en annen metode for å indusere AKI i voksen sebrafisk (figur 4), ved hjelp av cisplatin som et kjent nefrotoksisk middel som ikke ville ha direkte kjente effekter på fiskens mikrobiota, som gentamicinmodellen for å være et antibiotika, eller infeksjonen med E. tarda, for å være en sepsismodell. Men samtidig som vi utviklet cisplatinprotokollen vår, utforsket en annen gruppe også nefrotoksiske effekter av cisplatin hos voksen sebrafisk, og forenklet dosen til 10-20-30 μg per dyr68. Selv om de også viste cisplatin doseavhengig effekt i overlevelse, anbefaler vi forsiktighet ved bruk av en enkelt mengde cisplatin for alle fisk, da sebrafisk fra samme alder kan ha svært forskjellige størrelser og vekt, og dette kan indusere variasjoner i resultatene69,70. Vi tror det er viktig å justere dosen til dyrets tilsvarende vekt, som det gjøres hos mus og denne studien.
I våre eksperimenter med voksen sebrafisk viste cisplatin en doseresponseffekt. Dette ble visualisert ved å overvåke overlevelsesraten til dyrene etter cisplatinininjeksjon (figur 5). Vi brukte overlevelse som en måte å estimere intensiteten av dosen av cisplatin og ikke som et mål på nefrotoksisitet, da ingen andre fysiske tegn er synlige i løpet av overvåkingstiden. Dette kan sammenlignes med gnagere, hvor alvorlighetsgraden av nyreskaden kan moduleres ved dosering og hyppighet av cisplatin injeksjon15, oppnå dødelige doser med høyere konsentrasjoner av cisplatin71. Døde er også sett i de følgende dagene i larvalmodellen av cisplatin72. Siden vårt mål var å indusere en akutt skade på få dager, valgte vi 120 μg / g dose cisplatin som mulig for å observere nyreskade 24 timer etter injeksjonen, men dette kan justeres avhengig av målene i studien.
Hos mennesker diagnostiseres AKI klinisk ved redusert glomerulær filtreringshastighet (GFR), forhøyet serumkreatinin og blodurea nitrogen3. I sebrafisk inneholder repertoaret til AKI-modeller noen genetisk betingede modeller73,74 og noen legemiddelrelaterte modeller65,72, men som noen av AKI funksjonelle parametere kan ikke måles på sebrafisk på grunn av tekniske vanskeligheter(f.eks. blodsamling), vedtar de fleste forskning morfologiske og visuelle teknikker for å observere egenskapene til AKI1,75 som vår studie.
Hos gnagere kommer cisplatin inn i epitelcellene i de proksimale og distale tubuliene, inne i cellen gjennomgår metabolsk aktivering og blir svært reaktivt som virker på celleorganeller og induserer endringer i cellestrukturen. Disse endringene kan indusere apoptose og autofagi og til og med nekrose, ved svært høye doser. Som svar på denne skaden frigjøres mange cytokiner og leukocytter rekrutteres som fører til betennelse og påvirker funksjonaliteten til orgelet15. Dette understreker viktigheten av å vurdere hvilken type celler som finnes i den skadede nyren, som innbyggere eller infiltrerte immunceller. Her viste vi hvordan du vurderer dette ved strømningscytometri, ved hjelp av de transgene immunreporterlinjene som er tilgjengelige i dag (Tabell 1). Cisplatin økte prosentandelen nøytrofiler (mpo:GFP positive celler) i nyrene 24 timer etter injeksjonen (Figur 6). Når det gjelder sebrafisken, er nyrene nisjen til HSC-er som gir opphav til forskjellige blodcelletyper. Likevel sirkulerer mange granulocytter og makrofager normalt i blodet. I vårt eksempel brukte vi mpo: GFP transgen linje som uttrykker GFP under promotoren av myeloperoxidase av nøytrofiler52. Opprinnelige studier av mpo: GFP transgen linje demonstrert uttrykk for myeloperoxidase i ulike tilstander av nøytrofil modning76, men vår gate strategi fokusert på granulocytt brøkdel som består av modne celler som kommer fra blodet52, på denne måten vår analyse inkluderer infiltrerte celler og ikke bosatte celler. Dette er viktig å vurdere når du isolerer ønsket cellepopulasjon.
Som forklart ovenfor er apoptose den mest klassiske markøren for cisplatin-relatert AKI. Her demonstrerte vi en enkel protokoll for lokalisering av døde celler av TUNEL-analysen. Cisplatinininjeksjon økte antallet apoptotiske celler 24 hk (figur 7). Dette kan lett kvantifiseres ved å telle direkte de døde cellene fra vevet. Likevel, for identifisering av cellespesifikk død, kan bruk av antistoffer mot ønsket celle(f.eks. rørformede celler), eller bruk av en transgen reporterlinje brukes sammen med denne teknikken. Sammenlignet med den gentamicininduserte modellen av AKI, synes cisplatin å være en mer alvorlig modell, siden gentamicin apoptose var høyere på den tredje dagen etter injeksjon65.
Til tross for å ha en rekke bivirkninger, er cisplatin fortsatt mye brukt i kreftbehandling, på grunn av effektiviteten mot ulike typer kreft, inkludert karsinomer, bakteriecelletumorer, lymfomer og sarkomer77. Nefrotoksisitet forekommer hos en tredjedel av pasientene i behandling med cisplatin10, og dermed er søket etter strategier som kan redusere denne effekten og øke renoprotection viktig. Vi tror at metodene og teknikkene som presenteres i dette manuskriptet vil bidra til å belyse mekanismer for nyreskade og finne terapeutiske mål som kan være avgjørende for å forbedre livskvaliteten til personer som lider av nyrekomplikasjoner, hovedsakelig de som er relatert til bruk av cisplatin.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), finanskode 001. Vi takker våre samarbeidspartnere ved Laboratoriet til Maria Rita dos Santos e Passos-Bueno’s og Zebrafish Facility of the Genetics and Evolutionary Biology Department, i Bioscience Institute ved University of São Paulo. Vi takker Cristiane Naffah de Souza Breda og Theresa Raquel de Oliveira Ramalho for kommentarene og forslagene til manuskriptet. Vi setter stor pris på og takker Marcio Villar Martins, fra multimediateamet til Institute of Biomedical Sciences, for innspilling, utgave og produksjon av denne videoen.
1x PBS | Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water | ||
31 G 1.0 cc insulin syringe | BD Plastipak | 990256 | Needle: BD Precision Glide 300110 |
3.5 L Fish tank | Tecniplast | Part of the aquactic system | |
6 well plate | Corning | 351146 | |
10 mM Tris/HCl | Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000) | ||
50 ml Falcon tube | Corning | 352070 | |
2-3% Agarose | Invitrogen | 16500-500 | Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve. |
2% FBS | Gibco | 12657-09 | Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS |
4% Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 °C |
50% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
70% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
90% Ethanol | Made by diluting 100% ethanol in distilled water | ||
100% Ethanol | Synth | 00A1115.01.BJ | |
100% Xylene | Synth | 00X1001.11.BJ | |
Cell strainer 40 µm | Corning | 431750 | |
Cisplatin | Blau Farmacêutica | 16020227 | C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature. |
Cork board sheet | Obtained from local stationary store | ||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Stock solution 20 mg/ml dissolved in water |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Flow cytometry tubes | Corning | 352052 | |
Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
Histology cassette | Ciencor | 2921 | |
Immuno stain chamber | Ciencor | EP-51-05022 | |
Incubator | NAPCO | 5400 | Set to 37 °C |
Insect pins | Papillon | Model micro15x20 | |
In Situ Cell Death Detection Kit | Roche Diagnostics | 12156792910 | |
Metal mold | Leica Biosystems | 3803081 | |
Micropipette 200-1000 µL | Eppendorf | Use 1 mL tips | |
MS-222 (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040-25G | |
NaCl 0.9% | Synth | C1060.01.AG | Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water |
Nail polish | Prefer transparent | ||
Neubauer chamber | Precicolor HGB | ||
Pasteur plastic pipet | United Scientific Supplies | P31201 | |
Paraplast | Sigma-Aldrich | P3558 | |
Petri dish | J.ProLab | 0307-1/6 | 60 and 100 mm |
Plastic spoon | Obtained from local store | ||
Proteinase K | New England BioLabs | P8102 | Diluite from stock 20 mg/ml |
Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Scalpel blade | Solidor | ||
Sponge | Obtained from local store | ||
Trypan Blue | Cromoline | 10621/07 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Cytometer | BD Biosciences | FACSCanto II | |
Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
Fluorescence Microscope | Zeiss | AxioVert.A1 | |
Microtome | Leica | Jung Supercut | |
Scale | Ohaus Corporation | AR2140 |