أسلاك السيليكون النانوية والتحفيز البصري للتحقيقات من اقتران داخل وفيما بين الخلايا الكهربائية
Summary
يصف هذا البروتوكول استخدام أسلاك السيليكون النانوية للتشكيل الحيوي البصري داخل الخلايا في طريقة بسيطة وسهلة الأداء. هذه التقنية هي قابلة للتكيف مع أنواع الخلايا المتنوعة ويمكن استخدامها في المختبر وكذلك في التطبيقات الحية.
Abstract
يمكن أن تقوم Myofibroblasts بتلميم أسلاك السيليكون النانوية (SiNWs) بشكل تلقائي، مما يجعلها هدفًا جذابًا للتطبيقات الإلكترونية الحيوية. هذه الهجينة الخلية سيليكون تقدم قدرات التشكيل البصرية بلا رصاص مع الحد الأدنى من الانزعاج إلى سلوك الخلايا الطبيعية. يتم الحصول على القدرات البصرية من خلال الخصائص الحرارية الضوئية والحرارية الضوئية لـ SiNWs. ويمكن حصاد هذه الهجينة باستخدام تقنيات زراعة الأنسجة القياسية ومن ثم تطبيقها على سيناريوهات بيولوجية مختلفة. نحن نبرهن هنا كيف يمكن استخدام هذه الهجينة لدراسة اقتران الكهربائية من الخلايا القلبية ومقارنة كيف myofibroblasts الزوجين إلى بعضها البعض أو إلى cardiomyocytes. ويمكن إنجاز هذه العملية دون معدات خاصة تتجاوز المجهر الفلورسنت مع خط الليزر مقرونة. كما يظهر أيضا هو استخدام روتين MATLAB بنيت خصيصا التي تسمح الكم من انتشار الكالسيوم داخل وبين الخلايا المختلفة في الثقافة. وتظهر myofibroblasts أن يكون استجابة كهربائية أبطأ من تلك التي من cardiomyocytes. وعلاوة على ذلك، يظهر الانتشار بين الخلايا في myofibroblast أبطأ قليلاً، وإن كانت السرعات القابلة للمقارنة مع سرعاتها داخل الخلايا، مما يشير إلى الانتشار السلبي من خلال الوصلات الفجوة أو الأنابيب النانوية. هذه التقنية هي قابلة للتكيف للغاية ويمكن تطبيقها بسهولة على الساحات الخلوية الأخرى، لفي المختبر وكذلك في مجال الحي أو التحقيقات السابقة.
Introduction
جميع الكائنات الحية البيولوجية تستخدم الكهرباء، في شكل أيونات، لتنظيم السلوك الخلوي. تحتوي أغشية الخلايا على أنواع مختلفة من القنوات الأيونية المحددة التي تسمح بالنقل السلبي والنشط للأيونات. هذه الأيونات تحكم وظائف الخلايا منفعل, مثل نشاط الخلايا العصبية والهيكل العظمي والعضلات القلبية. ومع ذلك ، فإن الطاقة الكهربائية الحيوية تلعب أيضًا دورًا مهمًا في الخلايا غير القابلة للإثارة ، وتحكم العديد من الوظائف الخلوية مثل انتشار الخلايا1، و neuroimmunity2،3،4، وتمايز الخلايا الجذعية5.
وفي العقود الأخيرة، استقطب مجال الطاقة الكهربائية الأحيائية مستوى متزايدا من الاهتمام، مما أسهم في تطوير تكنولوجيات عديدة للواجهات الإلكترونية الحيوية. ميكروليكترود التصحيح الماصات هي المعيار الذهبي للتسجيل داخل الخلية والتحفيز6. في هذه المنهجية، يتم سحب ماصة زجاجية في ظل ظروف محددة لتشكيل حافة حادة مع حجم المسام من ميكرون قليلة. يتم تعبئة هذه الماصة مع المخزن المؤقت والماصة يسمح الاتصال المباشر من المخزن المؤقت مع حجم داخل الخلية. وهذا يؤدي إلى واجهة الطاقة الحيوية التي تسفر عن إشارة عالية للغاية إلى نسب الضوضاء، والسيطرة الدقيقة على النشاط الكهربائي الخلوي، ودقة الزمنية عالية للغاية. على الرغم من أن هذه المنهجية هي أداة قوية للغاية ، والتي تم تخفيضها مؤخرًا إلى تكوين nano-pipette7، إلا أنها ترتبط بالعديد من القيود التقنية الهامة. تأثير تخفيف السيتوسول8، وكذلك الاهتزازات الميكانيكية ، يحد فائدته على الاستجوابات قصيرة الأجل ، ويتطلب معدات متخصصة باهظة الثمن ومستوى عال من المهارة التقنية. وعلاوة على ذلك، فإن ضخامتها تحد من عدد الخلايا التي يمكن تسجيلها أو تحفيزها في وقت واحد، ونظراً لضخامتها، لا يمكن إعادة تكوينها طوال التجربة. للتغلب على هذه القيود، تم تطوير صفائف ميكروليكترودي، ولكن حجم الأقطاب يحد من الدقة المكانية وكذلك الوصول داخل الخلايا. Nanoelectrode صفائف تسمح داخل الخلايا التسجيل والتحفيز ولكن تتطلب electroporation جلخ للوصول إلى cytosol9،10. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جميع هذه المنهجيات مرتبطة الركيزة وبالتالي تقتصر على ثقافات الخلايا في المختبر ، أو الخلايا السطحية الخارجية ، مع عدم الوصول إلى الخلايا الموجودة داخل أنسجة ثلاثية الأبعاد .
Optogenetics11 يستخدم على نطاق واسع لمعالجة هذه القيود 3D و في الجسم الحي. ومع ذلك، تعتمد الطرق البصرية على الانزعاجات من القنوات الأيونية غشاء البلازما المنشطة للضوء التي يتم توزيعها في غشاء البلازما، والحد من 3D الاستبانة المكانية12 وقدرات داخل الخلايا.
لقد أظهرنا مؤخرا أن أسلاك السيليكون النانوية (SiNWs) يمكن استخدامها لأداء استجواب داخل الخلايا الكهربائية الحيوية مع دقة المكانية submicron مع خلايا مختلفة غير مثير، وهي myofibroblasts القلبية و oligodendrocytes13. وعلاوة على ذلك، استخدمنا هذه SiNWs لأداء السابقين vivo خلية استجواب محددة داخل أنسجة القلب 3D، للتحقيق في كيفية خلايا القلب زوجين كهربائيا في الجسم الحي14. وتتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذه المنهجية في بساطتها؛ لا يتطلب أي تعديل وراثي أو أجهزة ضخمة. العديد من الخلايا سوف استيعاب تلقائيا الصور المستجيبة SiNWs مع عدم وجود حاجة ل sonication أو electroporation15. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها سوف الهروب تلقائيا التغليف endosomal وتشكيل التكامل السلس مع العضيات الخلوية والخلايا13،15. هذه المركبات الخلية-SiNWs، يطلق عليه الهجينة الخلية السيليكون، تمتلك الطبيعة الديناميكية والناعمة وتنوعا للخلية الأصلية، فضلا عن القدرات البصرية من SiNWs. بعد التهجين, الخلية-SiNW الهجين يمكن حصادها باستخدام تقنيات زراعة الأنسجة القياسية واستخدامها في تطبيقات مختلفة مثل التحفيز الكهربائي الحيوي داخل الخلايا; دراسة اقتران الطاقة الحيوية بين الخلايا في المختبر؛ و في خلية الجسم الحي استجواب محدد. كما يتطلب التحفيز الفعال التوطين المشترك لكثافات الطاقة البصرية العالية وSINWs ، يمكن للمرء تحقيق دقة مكانية عالية في كل من 2D و 3D. في هذا البروتوكول، نُصف بالتفصيل المنهجية، وكذلك كيفية تحليل النتائج. ويتم التركيز على التحقيق داخل الخلايا وداخل الخلايا في المختبر، ولكن يمكن استخدام تنفيذ هذه المنهجية في الجسم الحي مباشرة في العديد من السيناريوهات البيولوجية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد أظهرنا هنا طريقة بسيطة لأداء التحفيز الكهربائي داخل الخلايا للخلايا. في هذه المظاهرة، استخدمنا صناديق الاستثمار المتعددة الأطراف التي كانت سابقة للتهجين مع الـ SiNWs، ثم شاركنا في الثقافة مع CMs. بشكل عام، معظم الخلايا المتكاثرة لديها ميل إلى استيعاب السيوين، مما يسمح باستخدام هذه المنه…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل مكتب القوات الجوية للبحث العلمي (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
Riferimenti
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
- Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).
- Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).
- Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
- Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
- Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).
- Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).
- . dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020)
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).
- Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
- Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
- Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).
- Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
- Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
- He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
- Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
- Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).
