Silizium-Nanodrähte und optische Stimulation für Untersuchungen der intra- und interzellulären elektrischen Kopplung

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Silizium-Nanodrähten für die intrazelluläre optische Biomodulation von Zellen in einer einfachen und einfach durchzuführenden Methode. Die Technik ist sehr anpassungsfähig an verschiedene Zelltypen und kann sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Anwendungen eingesetzt werden.

Abstract

Myofibroblasten können spontan Silizium-Nanodrähte (SiNWs) verinnerlichen und sind damit ein attraktives Ziel für bioelektronische Anwendungen. Diese Zell-Silizium-Hybride bieten bleifreie optische Modulationsfunktionen mit minimaler Störung des normalen Zellverhaltens. Die optischen Fähigkeiten werden durch die photothermischen und photoelektrischen Eigenschaften von SiNWs ermittelt. Diese Hybriden können mit Standard-Gewebekulturtechniken geerntet und dann auf verschiedene biologische Szenarien angewendet werden. Wir zeigen hier, wie diese Hybriden verwendet werden können, um die elektrische Kopplung von Herzzellen zu untersuchen und zu vergleichen, wie Myofibroblasten miteinander oder mit Kardiomyozyten verzahnt werden. Dieser Prozess kann ohne spezielle Ausrüstung jenseits eines Fluoreszenzmikroskops mit gekoppelter Laserlinie durchgeführt werden. Gezeigt wird auch die Verwendung einer maßgeschneiderten MATLAB-Routine, die die Quantifizierung der Kalziumvermehrung innerhalb und zwischen den verschiedenen Zellen in der Kultur ermöglicht. Myofibroblasten haben nachweislich eine langsamere elektrische Reaktion als Kardiomyozyten. Darüber hinaus zeigt die myofibroblast-interzelluläre Ausbreitung etwas langsamere, wenn auch vergleichbare Geschwindigkeiten mit ihren intrazellulären Geschwindigkeiten, was auf eine passive Ausbreitung durch Spaltknoten oder Nanoröhren hindeutet. Diese Technik ist sehr anpassungsfähig und kann leicht auf andere zelluläre Arenen angewendet werden, sowohl für In-vitro-, als auch in vivo- oder ex vivo-Untersuchungen.

Introduction

Alle biologischen Organismen nutzen Elektrizität in Form von Ionen, um das zelluläre Verhalten zu regulieren. Zellmembranen enthalten verschiedene Arten spezifischer Ionenkanäle, die den passiven und aktiven Transport von Ionen ermöglichen. Diese Ionen steuern die Funktionen von erregbaren Zellen, wie neuronale Aktivität und Skelett und Herzmuskelkontraktilität. Jedoch, Bioelektrizität spielt auch eine wichtige Rolle in nicht-erregbaren Zellen, die viele zelluläre Funktionen wie Zellproliferation^1,Neuroimmunität^2,3,4und Stammzelldifferenzierung⁵.

In den letzten Jahrzehnten hat der Bereich der Bioelektrizität ein wachsendes Interesse geweckt, was zur Entwicklung zahlreicher Technologien für bioelektronische Schnittstellen beigetragen hat. Mikroelektroden-Patchpipetten sind der Goldstandard der intrazellulären Aufzeichnung und Stimulation⁶. Bei dieser Methode wird eine Glaspipette unter bestimmten Bedingungen gezogen, um eine scharfe Kante mit einer Porengröße von wenigen Mikrometern zu bilden. Diese Pipette ist mit einem Puffer gefüllt und die Pipette ermöglicht den direkten Kontakt des Puffers mit dem intrazellulären Volumen. Daraus ergibt sich eine bioelektrische Schnittstelle, die extrem hohe Signal-Rausch-Verhältnisse, eine präzise Steuerung der zellulären elektrischen Aktivität und eine extrem hohe zeitliche Auflösung liefert. Obwohl diese Methode ein extrem leistungsfähiges Werkzeug ist, das vor kurzem auf eine Nanopipettenkonfiguration⁷herunterskaliert wurde, ist es mit mehreren wichtigen technischen Einschränkungen verbunden. Der Zytosolverdünnungseffekt⁸sowie mechanische Vibrationen beschränkt seinen Nutzen auf kurzfristige Verhöre und erfordert teure Spezialausrüstung und ein hohes Maß an technischem Geschick. Darüber hinaus begrenzt seine Sperrigkeit die Anzahl der Zellen, die gleichzeitig aufgezeichnet oder stimuliert werden können, und aufgrund seiner Invasivität kann es während eines Experiments nicht neu konfiguriert werden. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Mikroelektroden-Arrays entwickelt, aber die Größe der Elektroden begrenzt die räumliche Auflösung sowie den intrazellulären Zugang. Nanoelektroden-Arrays ermöglichen intrazelluläre Aufzeichnung und Stimulation, erfordern aber eine abrasive Elektroporation, um auf das Zytosol^9,10zugreifen zu können. Darüber hinaus sind alle diese Methoden substratgebunden und daher auf In-vitro-Zellkulturen oder auf externe oberflächliche Zellen beschränkt, ohne Zugang zu Zellen, die sich in einem dreidimensionalen (3D) Gewebe befinden.

Optogenetik¹¹ ist weit verbreitet, um diese 3D- und In-vivo-Beschränkungen zu beheben. Optogenetische Methoden basieren jedoch auf den Störungen von lichtaktivierten Plasmamembran-Ionenkanälen, die an der Plasmamembran verteilt werden, wodurch die räumliche 3D-Auflösung¹² und intrazelluläre Fähigkeiten begrenzt werden.

Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Silizium-Nanodrähte (SiNWs) verwendet werden können, um intrazelluläre bioelektrische Verhöre mit submikronräumlicher Auflösung mit verschiedenen nicht erregbaren Zellen durchzuführen, nämlich Herzmyofibroblasten und Oligodendrozyten¹³. Darüber hinaus verwendeten wir diese SiNWs, um ex-vivo zellspezifische Verhöre innerhalb eines 3D-Herzgewebes durchzuführen, um zu untersuchen, wie Herzzellen in vivo¹⁴elektrisch koppeln. Ein großer Vorteil dieser Methode ist ihre Einfachheit; es erfordert keine genetische Veränderung oder sperrige Instrumentierung. Viele Zellen verinnerlichen spontan fotoresponsive SiNWs ohne Beschallung oder Elektroporation¹⁵. Darüber hinaus entfliehen sie spontan der endosomalen Verkapselung und bilden eine nahtlose Integration mit den Zytosolen und intrazellulären Organellen^13,15. Diese Zell-SiNWs-Verbundwerkstoffe, sogenannte Zell-Silizium-Hybride, besitzen die dynamische, weiche und vielseitige Natur der ursprünglichen Zelle sowie die optoelektrischen Fähigkeiten der SiNWs. Nach der Hybridisierung kann der Zell-SiNW-Hybrid mit Standard-Gewebekulturtechniken geerntet und für verschiedene Anwendungen wie intrazelluläre bioelektrische Stimulation verwendet werden; Untersuchung der interzellulären bioelektrischen Kopplung in vitro; und für in vivo zellspezifische Verhöre. Da eine effektive Stimulation eine Kolokalisierung von hohen optischen Leistungsdichten und SiNWs erfordert, kann man sowohl in 2D als auch in 3D eine hohe räumliche Auflösung erzielen. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die Methodik sowie wie die Ergebnisse analysiert werden können. Der Schwerpunkt liegt auf der intra- und interzellulären Untersuchung in vitro, aber die in vivo Umsetzung dieser Methode kann direkt für viele andere biologische Szenarien genutzt werden.

Protocol

Um die Einhaltung ethischer Standards zu gewährleisten, wurden alle tiertierischen Verfahren im Zusammenhang mit der Isolierung von Kardiomyozyten aus Nagetierherzen zuerst vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Chicago genehmigt. Darüber hinaus wurden alle Tierversuche in vollständiger Übereinstimmung mit Anleitung der University of Chicago IACUC durchgeführt. 1. Herstellung von Zell-SiNWs-Hybriden Isolieren Sie primäre Kardiomyozyten (CMs) mit e…

Representative Results

Die Fähigkeit dieser Methode, einen direkten Zugang zum intrazellulären Zytosol zu ermöglichen, hängt von der spontanen Internalisierung des SiNW in die Zellen ab. Obwohl SiNWs einer spontanen Internalisierung in viele Zelltypen15unterzogen werden, werden einige Zellen, wie Kardiomyozyten und Neuronen, die SiNWs benötigen, um ihre Internalisierung zu ermöglichen19. In diesem Protokoll beschreiben wir den Internalisierungsprozess von p-i-n SiNWs mit 200-300 nm Durchmes…

Discussion

Wir haben hier eine einfache Möglichkeit zur intrazellulären elektrischen Stimulation von Zellen demonstriert. In dieser Demo haben wir MFs verwendet, die mit SiNWs vorhybridisiert und dann mit CMs kokultiviert wurden. Im Allgemeinen haben die meisten sich vermehrenden Zellen die Tendenz, SiNWs zu internalisieren, was die Verwendung dieser Methode mit vielen anderen Zelltypen ermöglicht. Darüber hinaus haben wir zwar die intrazelluläre Stimulation von Zellen demonstriert, aber die gleichen Prinzipien können verwend…

Materials

35 mm Glass bottom dishes	Cellvis	D35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal	3i
Calcein-AM	Invitrogen	C1430
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Invitrogen	C10045
Collagen I, rat tail	Gibco	A1048301
Deluxe Diamond Scribing Pen	Ted Pella	54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Gibco	10313039
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Falcon	08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,	Gibco	10082147
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FB11201
Fluo-4, AM, cell permeant	Invitrogen	F14201
FluoroBrite DMEM Media	Gibco	A1896701
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)	OKO
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Scientific	88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056