Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Silizium-Nanodrähten für die intrazelluläre optische Biomodulation von Zellen in einer einfachen und einfach durchzuführenden Methode. Die Technik ist sehr anpassungsfähig an verschiedene Zelltypen und kann sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Anwendungen eingesetzt werden.
Myofibroblasten können spontan Silizium-Nanodrähte (SiNWs) verinnerlichen und sind damit ein attraktives Ziel für bioelektronische Anwendungen. Diese Zell-Silizium-Hybride bieten bleifreie optische Modulationsfunktionen mit minimaler Störung des normalen Zellverhaltens. Die optischen Fähigkeiten werden durch die photothermischen und photoelektrischen Eigenschaften von SiNWs ermittelt. Diese Hybriden können mit Standard-Gewebekulturtechniken geerntet und dann auf verschiedene biologische Szenarien angewendet werden. Wir zeigen hier, wie diese Hybriden verwendet werden können, um die elektrische Kopplung von Herzzellen zu untersuchen und zu vergleichen, wie Myofibroblasten miteinander oder mit Kardiomyozyten verzahnt werden. Dieser Prozess kann ohne spezielle Ausrüstung jenseits eines Fluoreszenzmikroskops mit gekoppelter Laserlinie durchgeführt werden. Gezeigt wird auch die Verwendung einer maßgeschneiderten MATLAB-Routine, die die Quantifizierung der Kalziumvermehrung innerhalb und zwischen den verschiedenen Zellen in der Kultur ermöglicht. Myofibroblasten haben nachweislich eine langsamere elektrische Reaktion als Kardiomyozyten. Darüber hinaus zeigt die myofibroblast-interzelluläre Ausbreitung etwas langsamere, wenn auch vergleichbare Geschwindigkeiten mit ihren intrazellulären Geschwindigkeiten, was auf eine passive Ausbreitung durch Spaltknoten oder Nanoröhren hindeutet. Diese Technik ist sehr anpassungsfähig und kann leicht auf andere zelluläre Arenen angewendet werden, sowohl für In-vitro-, als auch in vivo- oder ex vivo-Untersuchungen.
Alle biologischen Organismen nutzen Elektrizität in Form von Ionen, um das zelluläre Verhalten zu regulieren. Zellmembranen enthalten verschiedene Arten spezifischer Ionenkanäle, die den passiven und aktiven Transport von Ionen ermöglichen. Diese Ionen steuern die Funktionen von erregbaren Zellen, wie neuronale Aktivität und Skelett und Herzmuskelkontraktilität. Jedoch, Bioelektrizität spielt auch eine wichtige Rolle in nicht-erregbaren Zellen, die viele zelluläre Funktionen wie Zellproliferation1,Neuroimmunität2,3,4und Stammzelldifferenzierung5.
In den letzten Jahrzehnten hat der Bereich der Bioelektrizität ein wachsendes Interesse geweckt, was zur Entwicklung zahlreicher Technologien für bioelektronische Schnittstellen beigetragen hat. Mikroelektroden-Patchpipetten sind der Goldstandard der intrazellulären Aufzeichnung und Stimulation6. Bei dieser Methode wird eine Glaspipette unter bestimmten Bedingungen gezogen, um eine scharfe Kante mit einer Porengröße von wenigen Mikrometern zu bilden. Diese Pipette ist mit einem Puffer gefüllt und die Pipette ermöglicht den direkten Kontakt des Puffers mit dem intrazellulären Volumen. Daraus ergibt sich eine bioelektrische Schnittstelle, die extrem hohe Signal-Rausch-Verhältnisse, eine präzise Steuerung der zellulären elektrischen Aktivität und eine extrem hohe zeitliche Auflösung liefert. Obwohl diese Methode ein extrem leistungsfähiges Werkzeug ist, das vor kurzem auf eine Nanopipettenkonfiguration7herunterskaliert wurde, ist es mit mehreren wichtigen technischen Einschränkungen verbunden. Der Zytosolverdünnungseffekt8sowie mechanische Vibrationen beschränkt seinen Nutzen auf kurzfristige Verhöre und erfordert teure Spezialausrüstung und ein hohes Maß an technischem Geschick. Darüber hinaus begrenzt seine Sperrigkeit die Anzahl der Zellen, die gleichzeitig aufgezeichnet oder stimuliert werden können, und aufgrund seiner Invasivität kann es während eines Experiments nicht neu konfiguriert werden. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Mikroelektroden-Arrays entwickelt, aber die Größe der Elektroden begrenzt die räumliche Auflösung sowie den intrazellulären Zugang. Nanoelektroden-Arrays ermöglichen intrazelluläre Aufzeichnung und Stimulation, erfordern aber eine abrasive Elektroporation, um auf das Zytosol9,10zugreifen zu können. Darüber hinaus sind alle diese Methoden substratgebunden und daher auf In-vitro-Zellkulturen oder auf externe oberflächliche Zellen beschränkt, ohne Zugang zu Zellen, die sich in einem dreidimensionalen (3D) Gewebe befinden.
Optogenetik11 ist weit verbreitet, um diese 3D- und In-vivo-Beschränkungen zu beheben. Optogenetische Methoden basieren jedoch auf den Störungen von lichtaktivierten Plasmamembran-Ionenkanälen, die an der Plasmamembran verteilt werden, wodurch die räumliche 3D-Auflösung12 und intrazelluläre Fähigkeiten begrenzt werden.
Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Silizium-Nanodrähte (SiNWs) verwendet werden können, um intrazelluläre bioelektrische Verhöre mit submikronräumlicher Auflösung mit verschiedenen nicht erregbaren Zellen durchzuführen, nämlich Herzmyofibroblasten und Oligodendrozyten13. Darüber hinaus verwendeten wir diese SiNWs, um ex-vivo zellspezifische Verhöre innerhalb eines 3D-Herzgewebes durchzuführen, um zu untersuchen, wie Herzzellen in vivo14elektrisch koppeln. Ein großer Vorteil dieser Methode ist ihre Einfachheit; es erfordert keine genetische Veränderung oder sperrige Instrumentierung. Viele Zellen verinnerlichen spontan fotoresponsive SiNWs ohne Beschallung oder Elektroporation15. Darüber hinaus entfliehen sie spontan der endosomalen Verkapselung und bilden eine nahtlose Integration mit den Zytosolen und intrazellulären Organellen13,15. Diese Zell-SiNWs-Verbundwerkstoffe, sogenannte Zell-Silizium-Hybride, besitzen die dynamische, weiche und vielseitige Natur der ursprünglichen Zelle sowie die optoelektrischen Fähigkeiten der SiNWs. Nach der Hybridisierung kann der Zell-SiNW-Hybrid mit Standard-Gewebekulturtechniken geerntet und für verschiedene Anwendungen wie intrazelluläre bioelektrische Stimulation verwendet werden; Untersuchung der interzellulären bioelektrischen Kopplung in vitro; und für in vivo zellspezifische Verhöre. Da eine effektive Stimulation eine Kolokalisierung von hohen optischen Leistungsdichten und SiNWs erfordert, kann man sowohl in 2D als auch in 3D eine hohe räumliche Auflösung erzielen. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die Methodik sowie wie die Ergebnisse analysiert werden können. Der Schwerpunkt liegt auf der intra- und interzellulären Untersuchung in vitro, aber die in vivo Umsetzung dieser Methode kann direkt für viele andere biologische Szenarien genutzt werden.
Wir haben hier eine einfache Möglichkeit zur intrazellulären elektrischen Stimulation von Zellen demonstriert. In dieser Demo haben wir MFs verwendet, die mit SiNWs vorhybridisiert und dann mit CMs kokultiviert wurden. Im Allgemeinen haben die meisten sich vermehrenden Zellen die Tendenz, SiNWs zu internalisieren, was die Verwendung dieser Methode mit vielen anderen Zelltypen ermöglicht. Darüber hinaus haben wir zwar die intrazelluläre Stimulation von Zellen demonstriert, aber die gleichen Prinzipien können verwend…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird vom Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503) unterstützt.
35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |