실리콘 나노 와이어 및 세포 간 전기 커플링의 조사를위한 광학 자극
Summary
이 프로토콜은 간단하고 수행하기 쉬운 방법으로 세포의 세포 내 광학 바이오 변조를위한 실리콘 나노 와이어의 사용을 설명합니다. 이 기술은 다양한 세포 유형에 매우 적응력이 뛰어나며 생체 내뿐만 아니라 생체 내 응용 분야에도 사용할 수 있습니다.
Abstract
Myofibroblasts는 자발적으로 실리콘 나노 와이어 (SiNWs)를 내면화 할 수 있습니다, 그들에게 바이오 전자 응용 프로그램에 대한 매력적인 대상이 될 수 있습니다. 이러한 셀-실리콘 하이브리드는 정상적인 세포 거동에 최소한의 교란을 통해 납없는 광학 변조 기능을 제공합니다. 광학 기능은 SiNWs의 광열 및 광전 특성에 의해 얻어진다. 이러한 하이브리드는 표준 조직 배양 기술을 사용하여 수확한 다음 다른 생물학적 시나리오에 적용할 수 있습니다. 우리는 이 혼성이 어떻게 심장 세포의 전기 결합을 연구하고 근섬유 세포가 서로 또는 심근세포에 어떻게 결합되는지 비교하기 위하여 어떻게 이용될 수 있는지 여기에서 보여줍니다. 이 과정은 결합 된 레이저 라인과 형광 현미경을 넘어 특별한 장비없이 달성 할 수 있습니다. 또한 배양시 다른 세포 들 사이 칼슘 전파의 정량화를 허용하는 맞춤형 MATLAB 루틴의 사용이 도시되어 있습니다. 근섬유 세포는 심근 세포보다 느린 전기 반응을 보이는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 근섬유세포 세포 간 전파는 약간 느리게 보여줍니다, 비록 그들의 세포 내 속도에 비교 속도, 갭 접합 또는 나노 튜브를 통해 수동 전파를 제안. 이 기술은 매우 적응력이 뛰어나며 생체 외뿐만 아니라 생체 내 또는 전 생체 내 조사를 위해 다른 셀룰러 경기장에 쉽게 적용 할 수 있습니다.
Introduction
모든 생물학적 유기체는 이온의 형태로 전기를 사용하여 세포 행동을 조절합니다. 세포막에는 이온의 수동적이고 능동적인 운반을 허용하는 다양한 유형의 특정 이온 채널을 함유하고 있습니다. 이 이온은 흥분하는 세포의 기능을 지배, 신경 활동 및 골격 및 심장 근육 수축 등. 그러나, 바이오전기는 또한 세포증식1,신경면역2,3,4,줄기세포 분화5와같은 많은 세포 기능을 지배하는 비흥분성 세포에서 중요한 역할을 한다.
최근 수십 년 동안 바이오 전기 분야는 점점 더 높은 관심을 불러 왔으며, 이는 바이오 전자 인터페이스를 위한 수많은 기술 개발에 기여했습니다. 마이크로 전극 패치 파이펫은 세포 내 기록 및 자극6의금 본위제이다. 이 방법론에서는 특정 조건에서 유리 파이펫을 당겨 공공 크기가 거의 없는 날카로운 모서리를 형성합니다. 이 파이펫은 버퍼로 채워지며 파이펫을 사용하면 세포 내 부피와 버퍼의 직접 접촉할 수 있습니다. 이로 인해 매우 높은 신호대 잡음 비, 셀룰러 전기 활동을 정밀하게 제어하며 매우 높은 시간적 분해능을 생성하는 바이오 전기 인터페이스가 생성됩니다. 이 방법론은 최근 나노 파이펫 구성7로축소 된 매우 강력한 도구이지만 몇 가지 중요한 기술적 한계와 관련이 있습니다. 사이토솔 희석 효과8,기계적 진동뿐만 아니라, 단기 심문에 유틸리티를 제한하고, 고가의 전문 장비와 높은 수준의 기술 기술이 필요합니다. 더욱이, 그것의 부피가 기록되거나 동시에 자극될 수 있는 세포의 수를 제한하고, 그것의 침략으로 인해, 실험을 통해 재구성될 수 없습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 마이크로 전극 어레이가 개발되었지만 전극의 크기는 세포 내 액세스뿐만 아니라 공간 해상도를 제한합니다. 나노 전극 어레이는 세포 내 기록 및 자극을 허용하지만 사이토솔9,10에액세스하기 위해 연마 전기 포기가 필요합니다. 또한, 이러한 모든 방법론은 기판에 결합되어 따라서 체외 세포 배양, 또는 외부 피상 세포로 제한되며, 3차원(3D) 조직 내부에 있는 세포에 접근할 수 없다.
광유전학(11)은 이러한 3D 및 생체 제한 문제를 해결하기 위해 널리 사용된다. 그러나, 광유전학적 방법은 혈장 막에 분포되는 광 활성화 플라즈마 멤브레인 이온 채널의 동요를 기반으로 하며, 3D 공간해상도(12)와 세포내 기능을 제한한다.
우리는 최근에 실리콘 나노 와이어 (SiNWs)가 다른 비 흥분 세포, 즉 심장 근섬유 세포 및 올리고덴드로키테(13)와하위 micron 공간 해상도와 세포 내 생물 전적 심문을 수행하는 데 사용할 수 있음을 보여 주었다. 더욱이, 우리는 3D 심장 조직 내에서 전 생체 세포 특정 심문을 수행하기 위해 이러한 SiNWs를 사용하여 심장 세포가 생체14에서전기적으로 결합하는 방법을 조사하였다. 이 방법론의 주요 장점은 단순함입니다. 그것은 어떤 유전 적 변형 또는 부피가 큰 계측을 필요로하지 않습니다. 많은 세포가 초음파 처리 또는 전기화15에대한 필요없이 자발적으로 사진 반응 SiNWs를 내면화합니다. 또한, 그들은 자발적으로 내피 캡슐화를 탈출하고 사이토솔 및 세포 내세포세포(13,15)와원활한 통합을 형성한다. 셀-실리콘 하이브리드라고 불리는 이 셀-SiNWs 복합체는 SiNWs의 연동적이고 부드럽고 다재다능한 특성뿐만 아니라 SiNWs의 광전 기능을 가지고 있습니다. 혼성화 후, 세포-SiNW 하이브리드는 표준 조직 배양 기술을 사용하여 수확하고 세포내 바이오전 자극과 같은 다양한 용도에 사용될 수 있다; 체외에서 세포 간 바이오 전기 커플링을 공부; 그리고 생체 내 세포 특정 심문. 효과적인 자극은 높은 광학 전력 밀도와 SiNWs의 공동 국소화가 필요하므로 2D 및 3D 모두에서 높은 공간 해상도를 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 방법론뿐만 아니라 결과를 분석할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 초점은 체외에서 세포 내 및 세포 간 조사에 배치됩니다, 그러나 이 방법론의 생체 내 구현은 많은 그밖 생물학 시나리오에 직접 이용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에서 세포의 세포내 전기 자극을 수행하는 간단한 방법을 시연했습니다. 이 데모에서는 SiNWs와 사전 혼성화된 MF를 사용한 다음 CM과 공동 배양했습니다. 일반적으로, 대부분의 증식 세포는 SiNWs를 내면화하는 경향이 있습니다, 이는 많은 다른 세포 모형을 가진 이 방법론의 사용을 허용합니다. 더욱이, 우리는 세포의 세포 내 자극을 입증하는 동안, 동일한 원리는 세포의 세포 외 자극을…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 과학 연구의 공군 사무실에 의해 지원됩니다 (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
Riferimenti
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
- Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).
- Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).
- Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
- Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
- Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).
- Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).
- . dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020)
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).
- Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
- Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
- Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).
- Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
- Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
- He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
- Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
- Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).
