Este protocolo descreve o uso de nanofios de silício para bio modulação óptica intracelular de células em um método simples e fácil de executar. A técnica é altamente adaptável a diversos tipos de células e pode ser usada para aplicações in vitro e in vivo.
Myofibroblasts pode internalizar espontaneamente nanofios de silício (SiNWs), tornando-os um alvo atraente para aplicações bioeletrônicas. Esses híbridos de silício celular oferecem capacidades de modulação óptica sem chumbo com perturbação mínima ao comportamento celular normal. As capacidades ópticas são obtidas pelas propriedades fototérmicas e fotoelétricas dos SiNWs. Esses híbridos podem ser colhidos usando técnicas padrão de cultura tecidual e, em seguida, aplicados a diferentes cenários biológicos. Demonstramos aqui como esses híbridos podem ser usados para estudar o acoplamento elétrico das células cardíacas e comparar como os miofibroblasts se casam uns com os outros ou com cardiomiócitos. Este processo pode ser realizado sem equipamento especial além de um microscópio fluorescente com linha laser acoplada. Também é mostrado o uso de uma rotina MATLAB personalizada que permite a quantificação da propagação de cálcio dentro e entre as diferentes células da cultura. Myofibroblasts são mostrados ter uma resposta elétrica mais lenta do que a de cardiomiócitos. Além disso, a propagação intercelular myofibroblast mostra velocidades ligeiramente mais lentas, embora comparáveis às suas velocidades intracelulares, sugerindo propagação passiva através de junções de lacunas ou nanotubos. Essa técnica é altamente adaptável e pode ser facilmente aplicada a outras arenas celulares, tanto para investigações in vitro quanto in vivo ou ex vivo.
Todos os organismos biológicos usam eletricidade, na forma de íons, para regular o comportamento celular. As membranas celulares contêm vários tipos de canais de íons específicos permitindo o transporte passivo e ativo de íons. Esses íons regem as funções das células excitáveis, como atividade neuronal e contratude muscular esquelética e cardíaca. No entanto, a bioeletricidade também desempenha um papel importante em células não excitáveis, regendo muitas funções celulares como a proliferação celular1, neuroimunidade2,3,4, e diferenciação de células-tronco5.
Nas últimas décadas, o campo da bioeletricidade tem atraído um nível crescente de interesse, o que tem contribuído para o desenvolvimento de inúmeras tecnologias para interfaces bioeletrônicas. Pipetas de patch de microeletrodo são o padrão ouro de gravação intracelular e estimulação6. Nesta metodologia, uma pipeta de vidro é puxada em condições específicas para formar uma borda afiada com um tamanho de poros de poucos mícrons. Esta pipeta é preenchida com um tampão e a pipeta permite o contato direto do buffer com o volume intracelular. Isso resulta em uma interface bioelétrica que produz relações de sinal a ruídos extremamente altas, controle preciso sobre a atividade elétrica celular e resolução temporal extremamente alta. Embora essa metodologia seja uma ferramenta extremamente poderosa, que recentemente foi desescalada para uma configuração de nano-pipeta7,está associada a várias limitações técnicas importantes. O efeito de diluição do citosol8,bem como vibrações mecânicas, limita sua utilidade a interrogatórios de curto prazo, e requer equipamentos especializados caros e um alto nível de habilidade técnica. Além disso, sua volumosidade limita o número de células que podem ser registradas ou estimuladas simultaneamente, e devido à sua invasividade, não pode ser reconfigurada ao longo de um experimento. Para superar essas limitações, foram desenvolvidas matrizes de microeletrodos, mas o tamanho dos eletrodos limita a resolução espacial, bem como o acesso intracelular. As matrizes nanoeletríndulas permitem gravação e estimulação intracelulares, mas requerem eletroporação abrasiva para acessar o citosol9,10. Além disso, todas essas metodologias são ligadas a substratos e, portanto, estão limitadas a culturas celulares in vitro, ou a células superficiais externas, sem acesso a células que estão dentro de um tecido tridimensional (3D).
A optogenética11 é amplamente utilizada para lidar com essas limitações 3D e in vivo. No entanto, os métodos optogenéticos são baseados nas perturbações dos canais de íons de membrana plasmática ativados pela luz que são distribuídos na membrana plasmática, limitando a resolução espacial 3D12 e as capacidades intracelulares.
Recentemente mostramos que os nanofios de silício (SiNWs) podem ser usados para realizar interrogatórios bioelétricos intracelulares com resolução espacial submicron com diferentes células não excitáveis, ou seja, miofibroblasts cardíacos e oligodenrócitos13. Além disso, usamos esses SiNWs para realizar interrogatórios específicos de células ex-vivo dentro de um tecido cardíaco 3D, para investigar como as células cardíacas se acoplam eletricamente in vivo14. Uma grande vantagem dessa metodologia é sua simplicidade; não requer qualquer modificação genética ou instrumentação volumosa. Muitas células internalizarão espontaneamente SiNWs foto-responsivos sem necessidade de sônica ou eletroporação15. Além disso, eles escaparão espontaneamente do encapsulamento endosomal e formarão uma integração perfeita com as organelas citosol e intracelular13,15. Esses compostos célula-SiNWs, denominados híbridos de silício celular, possuem a natureza dinâmica, suave e versátil da célula original, bem como as capacidades optoelétricas dos SiNWs. Após a hibridização, o híbrido celular-SiNW pode ser colhido utilizando técnicas padrão de cultura tecidual e usado para diversas aplicações, como estimulação bioelétrica intracelular; estudar o acoplamento bioelétrico intercelular in vitro; e para interrogatório específico de célula in vivo. Como uma estimulação eficaz requer a co-localização de altas densidades de energia óptica e SiNWs, pode-se alcançar alta resolução espacial tanto em 2D quanto em 3D. Neste protocolo descrevemos detalhadamente a metodologia, bem como como os resultados podem ser analisados. O foco é colocado na investigação intra e intercelular in vitro, mas a implementação in vivo dessa metodologia pode ser utilizada diretamente para muitos outros cenários biológicos.
Nós demonstramos aqui uma maneira simples de realizar estimulação elétrica intracelular das células. Nesta demonstração, usamos MFs que foram pré-fabricados com SiNWs, depois co-cultivados com CMs. Em geral, a maioria das células que proliferam tem a tendência de internalizar SiNWs, o que permite o uso dessa metodologia com muitos outros tipos de células. Além disso, enquanto demonstramos a estimulação intracelular das células, os mesmos princípios podem ser usados para realizar estimulação extracelular…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea (AFOSR FA9550-18-1-0503).
35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |