Analyse et spécification des distributions de taille granule d’amidon

Summary

Présenté ici est une procédure pour les déterminations reproductibles et statistiquement valides des distributions de taille granule d’amidon, et pour spécifier les distributions déterminées de taille lognormal de granule utilisant une forme multiplicative à deux paramètres. Il s’applique à toutes les analyses de dimensionnement granulés d’échantillons d’amidon à l’échelle graminale pour la recherche en sciences végétales et alimentaires.

Abstract

L’amidon de toutes les sources végétales est composé de granulés dans une gamme de tailles et de formes ayant des fréquences d’occurrence différentes, c’est-à-dire présentant une taille et une répartition desformes. Les données sur la taille des granules d’amidon déterminées à l’aide de plusieurs types de techniques de dimensionnement des particules sont souvent problématiques en raison d’une faible reproductibilité ou d’un manque de signification statistique résultant de certaines erreurs systématiques insurmontables, y compris la sensibilité aux formes granuleuses et aux limites des tailles des échantillons de granules. Nous avons décrit une procédure pour les déterminations reproductibles et statistiquement valides des distributions de taille granule d’amidon utilisant la technique de zone de détection électrique, et pour spécifier les distributions déterminées de taille lognormal de granule utilisant une forme multiplicative adoptée à deux paramètres avec une précision et une comparabilité améliorées. Il s’applique à toutes les analyses de dimensionnement granuleux d’échantillons d’amidon à l’échelle graminée et, par conséquent, pourrait faciliter les études sur la façon dont la taille des granules d’amidon est moulée par l’appareil et les mécanismes de biosynthèse de l’amidon; et comment ils ont un impact sur les propriétés et la fonctionnalité des amidons pour les utilisations alimentaires et industrielles. Les résultats représentatifs sont présentés à partir d’analyses de reproduction des distributions granulées d’échantillons d’amidon de la patate douce à l’aide de la procédure décrite. Nous avons en outre discuté de plusieurs aspects techniques clés de la procédure, en particulier, la spécification multiplicative des distributions de taille lognormal granule et certains moyens techniques pour surmonter le blocage fréquent de l’ouverture par granulés.

Introduction

Les granules d’amidon sont la structure physique dans laquelle deux polymères homoglucanes de réserve principaux dans les tissus de photosynthèse et de stockage des plantes, l’amylose linéaire ou peu ram ram ramée et l’amylopectine fortement ram ramée, sont emballés de façon ordonnée avec quelques composants mineurs, y compris les lipides et les protéines. Les granules d’amidon de diverses espèces végétales présentent de nombreuses formes tridimensionnelles (3D) (examinées en réf.^1,2),y compris des sphères, des ellipsoides, des polyèdres, des plaquettes, des cubes, des cuboïdes et des tubules irréguliers. Même ceux du même tissu ou de tissus différents d’une même espèce végétale pourraient avoir un ensemble de formes avec des fréquences d’occurrence variables. En d’autres termes, les granules d’amidon d’une espèce végétale peuvent avoir une répartition statistique caractéristique de la forme, plutôt qu’une forme spécifique. Les formes granuleuses non uniformes et non sphériques rendent difficile la mesure et la définition adéquates de la taille des granules d’amidon. En outre, les granules d’amidon provenant des mêmes tissus d’une espèce végétale sont d’une gamme de tailles avec des proportions différentes, c’est-à-dire présentant une répartition caractéristique de la taille. Cette distribution de taille complique encore l’analyse et la description des tailles de granules d’amidon.

La taille des granules d’amidon a été analysée à l’aide de plusieurs catégories de techniques de dimensionnement des particules (examinées à^{l’réf. 3),}y compris la microscopie, la sédimentation/fractionnement du débit de champ stérique (Sd/StFFF), la diffraction laser et la zone de détection électrique (ESZ). Cependant, ces techniques ne sont pas également adaptées à la détermination des tailles de granules d’amidon en présence d’une forme granule et d’une distribution de taille. La microscopie, y compris la microscopie électronique légère, confoccale et à balayage, est excellente pour les études de morphologie^4,5^,6,7, structure^{8,9 et} développement^10,11 de granules d’amidon, mais à peine adapté pour définir leurs distributions de taille en raison de certaines lacunes inhérentes. Les mesures directes d’images microscopiques de granules ou d’analyses d’images assistées par logiciel de données de microscopie optique (IAOM), qui ont été utilisées pour la détermination de la taille des granules d’amidons de plusieurs espèces, dont^{le maïs 12,le blé 13,le 14,la pomme de terre 15 et l’orge 16,}ne peuvent mesurer que des images 1D (généralement de longueur maximale) ou 2D (surface) de nombres très limités (de dizaines à quelques milliers) d’images de granule d’amidon. Les petites tailles d’échantillonnage de granules qui sont intrinsèquement limitées par les techniques pourraient rarement être statistiquement représentatives, compte tenu des énormes nombres de granules par unité de poids de l’amidon (~120 x^{10 6} par gramme, en supposant que les sphères de 10 μm à 1,5 g/cm³ de densité) et, par conséquent, pourraient conduire à une mauvaise reproductibilité des résultats. La technique Sd/StFFF peut avoir une vitesse et une résolution élevées, et des fractions de taille étroite de granules d’amidon¹⁷, mais a été rarement utilisé probablement parce que sa précision pourrait être gravement affectée par des dommages, des formes différentes, et la densité des granules d’amidon. La technique de diffraction laser est la plus largement utilisée, et a été appliquée pour des analyses de taille granule d’amidon pour toutes les grandes espèces^{de cultures 3,14,16}. Bien que la technique présente de nombreux avantages, elle n’est en fait pas adaptée à la détermination de la taille des granules d’amidon en présence d’une distribution de forme granulée. La plupart des instruments simultanés de diffraction laser s’appuient sur la théorie mie de diffusion de la^{lumière 18} pour les particules sphériques uniformes et sur la théorie modifiée de Mie¹⁸ pour d’autres formes d’uniformité. La technique est donc intrinsèquement très sensible aux formes de particules, et n’est pas tout à fait adaptée, même pour certaines formes d’uniformité¹⁹, et encore moins pour les granules d’amidon ayant un ensemble de formes de proportions différentes. La technique ESZ mesure la perturbation du champ électrique proportionnelle au volume de la particule passant par une ouverture. Il fournit des tailles de volume granulés, ainsi que les informations de distribution de nombre et de volume, etc., à haute résolution. Étant donné que la technique ESZ est indépendante des propriétés optiques des particules, y compris la couleur, la forme, la composition ou l’indice réfractif, et que les résultats sont très reproductibles, elle est particulièrement adaptée pour déterminer les distributions de taille des granules d’amidon ayant un ensemble de formes.

La taille des granules d’amidon a également été définie à l’aide de nombreux paramètres. Ils ont souvent été décrits de façon simpliste par diamètres moyens, qui dans certains cas étaient les moyens arithmétiques des longueurs maximales microscopiquement mesurées des images 2D^12,20, ou moyennes de diamètres de sphère équivalents³. Dans d’autres cas, les distributions de la taille du granule ont été spécifiées en utilisant des plages^{de taille 21,22}, le volume moyen de distribution ou le diamètre moyen (équivalent sphère, pondéré par nombre, volume ou surface) en supposant une distribution normale^{14,23,24,25,26}. Ces descripteurs de granules d’amidon provenant de diverses analyses sont d’une nature très différente, et pas strictement comparables. Il pourrait être très trompeur si ces « tailles » de granules d’amidon de différentes espèces ou même les mêmes tissus de la même espèce ont été directement comparés. De plus, le paramètre de propagation (ou de forme) des distributions normales présumées, c’est-à-dire l’écart type σ (ou écart type graphique σ_g)mesurant la largeur de la distribution (c.-à-d. la propagation des tailles), a été ignoré dans la plupart des études.

Afin de résoudre les problèmes critiques susmentionnés liés aux analyses de dimensionnement du granule d’amidon, nous avons décrit une procédure de détermination reproductible et statistiquement valide des distributions de granules des échantillons d’amidon à l’aide de la technique ESZ, et pour bien spécifier les distributions de taillenormales de granules déterminées à l’aide d’une forme multiplicative à deux paramètres^{adoptée 27} avec une précision et une comparabilité améliorées. Pour la validation et la démonstration, nous avons effectué des analyses de dimensionnement de granules de réplication d’échantillons d’amidon de sweetpotato à l’aide de la procédure, et spécifié les distributions différentielles lognormal volume-pourcentage volume-équivalent-sphère diamètre en utilisant leurs moyens géométriques graphiques et multiplicatifs écarts types s* dans ^{un x}/ (multiplier et diviser) s* forme.

Protocol

1. Préparation d’échantillons d’amidon Préparer deux (ou trois) échantillons d’amidon de reproduction à l’échelle du gramme provenant de tissus accumulant de l’amidon de diverses espèces végétales selon les procédures établies (p. ex., pommesde terre 15,patatesdouces 28,grainsde blé 13,29et grains demaïs 30,etc.). Lavez soigneusement les échantillon…

Representative Results

Pour valider la procédure, et démontrer la reproductibilité de la distribution déterminée de taille de granule, nous avons exécuté reproduire des analyses de dimensionnement des échantillons d’amidon de sweetpotato. Nous avons préparé des échantillons d’amidon de reproduction (S1 et S2) provenant de patates douces cultivées en champ d’une lignée de reproduction SC1149-19 à un âge de développement similaire à l’aide d’une procédureprécédemment décrite 28. De chaque ex…

Discussion

La procédure décrite a résolu certains problèmes critiques dans plusieurs méthodes existantes pour les analyses de la taille des granules d’amidon, y compris le dimensionnement 1D ou 2D inapproprié des granules 3D, la distorsion des mesures de dimensionnement en raison de formes granulés non uniformes, une faible reproductibilité et une validité statistique douteuse en raison de tailles limitées échantillon granuleux, spécification inexacte ou incorrecte (en particulier l’utilisation de la taille moyenne)…

Materials

Analytical beaker	Beckman Coulter Life Sciences	A35595	Smart-Technology (ST) beaker
Aperture tube, 100 µm	Beckman Coulter Life Sciences	A36394	For the MS4E, , 1000 µm
Disposable transfer pipettor,	Fisher Scientific (Fishersci.com)	13-711-9AM	Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used.
Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml	Fisher Scientific (Fishersci.com)	05-539-13	Any other similar types of tubes can be used.
Glass beakers, 150 to 250 ml	Fisher Scientific (Fishersci.com)	02-540K	These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirer between runs.
LiCl	Fisher Chemical	L121-100
Methanol	Fisher Chemical	A412-500	Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol.
Mettler Toledo ML-T Precision Balances	Mettler Toledo	30243412	Any other precision balance with a readablity 0.01 g to 1 mg will work.
Multisizer 4e Coulter Counter	Beckman Coulter Life Sciences	B23005	The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company.
Ultrasonic processor UP50H	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H	Other laborator sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension.