Здесь представлен протокол микроинъекционного и одновременного изображения нескольких эмбрионов дрозофилы во время эмбрионального развития с использованием изображения на основе пластин с высоким содержанием.
Современные подходы в количественной визуализации живых клеток стали важным инструментом для изучения клеточной биологии, позволяя использовать статистику и вычислительное моделирование для классификации и сравнения биологических процессов. Хотя системы модели клеточной культуры отлично подходят для визуализации высокого содержания, высокопрочные исследования клеточной морфологии показывают, что культуры ex vivo ограничены в повторном воспроизведении морфологической сложности, найденной в клетках в живых организмах. Таким образом, существует необходимость в масштабируемой высокой пропускной способности модели системы для изображения живых клеток в нетронутом организме. Описано здесь протокол для использования анализа изображений с высоким содержанием одновременно приобрести несколько замедленного видео эмбрионального развития Drosophila melanogaster во время синцитиальной стадии бластодерма. Синцитиальный бластодерм традиционно служил отличной моделью in vivo для визуализации биологических событий; однако получение значительного числа экспериментальных репликаций для количественных и высокоопутных подходов было трудоемким и ограничивалось визуализацией одного эмбриона на экспериментальное повторение. Здесь представлен метод адаптации подходов к визуализации и микроинъекции в соответствии с системой визуализации высокого содержания или любым перевернутым микроскопом, способным к автоматическому приобретению многоточек. Такой подход позволяет одновременно приобретение 6-12 эмбрионов, в зависимости от желаемых факторов приобретения, в течение одного сеанса визуализации.
За последние 30 лет достижения в области технологий визуализации и молекулярных зондов для визуализации живых клеток продвинули наше понимание сложности и внутренней работы клетки. Сопровождающим этот прогресс в технологии является большая зависимость от использования моделей культуры ex vivo для получения данных с высокой пропускной способностью изображений. Модели клеточной культуры обеспечивают ряд преимуществ, в том числе контроль микроокноронности через микрофлюидные системы, а также способность изображения нескольких клеток одновременно, что позволяет использовать количественные подходы, необходимые для высокой пропускнойспособности скрининга 1,2. Однако, Есть также значительные недостатки, связанные с моделями клеточной культуры в контексте морфологических исследований, таких как двумерные стеклянные или пластиковые поверхности, производящие смешанные эффекты наморфологию клеток и ее регулирование 3,4,5. Эти эффекты могут предоставить ложные или вводящие в заблуждение данные в отношении изучения биологических процессов, регулирующих клеточную морфологию.
Хотя альтернативой было изучение клеточной морфологии в контексте нетронутогоорганизма 6, несколько подходящих нетронутых организмовспособствуют высокой пропускной способности количественной визуализации живых клеток из-за трудностей в поддержании жизни целых организмов через вне изображения, и проблемы, связанные с изображением внутри большого многоклеточного организма. В результате, биологические исследования клеток в нетронутых организмах, как правило, сосредоточены на наблюдении одного организма с течением времени, что значительно ограничивает размер выборки. Кроме того, это ограничение на использование изображений в реальном времени затрудняет и обходится дорого в виде экрана и ограничивает возможность применения количественных аналитических инструментов, поскольку количество образцов, как правило, слишком мало. Таким образом, возникает необходимость в многоклеточной модели организма, который может быть использован для высококонтентных количественных подходов.
Этот протокол адаптирует эмбрион Drosophila для изображений с высоким содержанием пластин для создания экспериментальных размеров образцов, достаточно больших для количественного анализа. Drosophila меланогастер широко известен как первая модель организма. Исследования с использованием дрозофилы привели к прорывам в клеточной и молекулярной биологии, включая передачу генетической информации, идентификацию путей сигнализации клеток, а такжегенетические требования эмбрионального развития 7,8,9. Кроме того, эмбрион дрозофилы был использован для изучения динамики микротрубочек in vivo вовремя клеточного деления 10,11,12. Использование микроинъекции для доставки малых молекул и молекулярных зондов обеспечивает временный контроль, что делает эмбриональное развитие Дрозофилы особенно мощным для зондирования клеточных процессов in vivo13,14. Тем не менее, создание значительного числа экспериментальных повторов с традиционным подходом к визуализации является чрезвычайно трудоемким и имеет ограниченное использование в высокой пропускной способности экранов изображений и количественного анализа. Наш подход использует анализатор высокого содержания, обычно зарезервированный для анализа одной клетки, и адаптирует анализ изображений in vivo в синцитиуме раннего Drosophila embryo.
Этот протокол был использован для сбора, стадии, и микроинъект drosophila эмбрионов для изучения механизмов, которые управляют морфологических изменений в эндоплазмической reticulum (ER) во времямитоза 15. Хотя многие исследования изложили динамический характер ER во время клеточногоцикла 16,17,18,19, было трудно сравнить последствия многочисленных возмущений во времени на ER морфологии. Для определения компонентов, которые управляют изменениями в морфологии ER через деление клеток, методы, перечисленные в этом протоколе, были использованы для зондирования роли микротрубочек и других цитоскелетных факторов на митотической реорганизации ER с использованием коркового синцитиального деления в раннем эмбрионе дрозофилы. В совокупности наличие генетических возмущений в сообществе дрозофилы, способность к микроинъекции наркотиков и молекулярных зондов в точное время во время разработки, а также недорогая стоимость работы с Drosophila делает этот подход весьма приемлемым для высокой пропускной способности изображения на основе скрининга. Описанные здесь методы применимы для изучения широкого спектра клеточных и процессов развития in vivo с использованием эмбриона Дрозофилы 20. В частности, этот протокол хорошо приспособлен для изучения биологических событий, которые происходят в течение длительного периода и в пределах 100 микрон коры эмбриона Дрозофилы.
Описанный здесь протокол является весьма универсальным и легко адаптируемым для изучения биологических событий на различных стадиях эмбрионального развития Дрозофилы. Этот протокол хорошо подходит для изучения биологических процессов, которые происходят в течение длительных периодов времени. Например, исследования клетчатой29,30 или формирование гетерохроматина доменов в Drosophila31,32может извлечь выгоду из использованияметодов,описанных в этом протоколе, поскольку эти процессы происходят в течение длительного периода времени. Кроме того, размер выборки может быть увеличен за счет уменьшения увеличения для изучения вопросов, которые требуют меньше оптического разрешения, таких как время между синцитиальнымиподразделениями 33 или продолжительностьгастрипуляции 34. Аналогичным образом, цель 20x позволяет двум эмбрионам быть изображены в одной плоскости изображения. Методы, используемые в этом протоколе, обеспечивают динамичную платформу для задавать биологические вопросы, используя эмбриональное развитие в качестве образцовой системы количественного анализа.
В этом протоколе есть три важных шага. После декорионации в 50% отбеливатель крайне важно, чтобы эмбрионы промыть и высушить энергично 5 раз (2.3.4). Этот шаг удаляет оставшиеся мелкие кусочки хориона. Оставшийся хорион будет препятствовать поле зрения при визуализации эмбриона. При монтаже эмбрионов на стеклянную крышку (3,5) важно прижимать эмбрионы к клею с равномерного давления. Это поместит эмбрионы на той же плоскости z. При резке открыть микроинъекции иглы, важно, чтобы втягивать поршень немедленно регулировать скорость потока иглы или вы потеряете все ваши инъекционные.
Наше исследование было ограничено двумя факторами. Первым фактором было не наличие автоматизированного процесса сегментации. Однако мы разработали сценарий ручной сегментации с помощью MATLAB; с генетически закодированным маркером шпинделя этот процесс может быть автоматизирован. В будущем мы хотели бы производить CNN-RFP21, Rtln1-GFP и CNN-RFP; Трансгенные линии ReepB-GFP для автоматической сегментации шпинделя. Для получения дополнительной информации о нашем скрипте и анализе трубопровода MATLAB, обратитесь к дополнительным материалам Diaz et al.15. Во-вторых, мы также были ограничены нашим интервалом приобретения 35 с, что позволило нам только изображение 6 эмбрионов одновременно. Более длительный интервал приобретения позволит нам изображение больше эмбрионов одновременно. Хотя пропускная способность доставки лекарств может быть увеличена за счет замены микроинъекции шагом пронизывания, мы обнаружили, что это было ненужным, так как наш размер выборки уже был ограничен интервалом приобретения.
В то время как этот протокол был использован для изображения эмбрионального развития Drosophila, общий подход адаптируется для изучения эмбрионального развития в других многоклеточных модельных системах, таких как C. elegans,Sea Urchins и Xenopus. Эмбрионы чрезвычайно полезны для количественного анализа, так как они легко синхронизируются путем сбора или оплодотворения. Кроме того, эмбрионы не двигаются и не уплывает из поля зрения, что позволяет использовать простое многоапунктное программное обеспечение, способное создавать видео замедленного действия для количественного анализа. Хотя мы использовали анализатор высокого содержания в нашем исследовании, любая перевернутая микроскоповая система, способная к многотойной приобретению, может быть в паре с методами, упомянутыми в настоящем.
Аналогичные результаты можно получить с помощью многоточенного приобретения, способного перевернутого конфокального микроскопа; однако преимущества анализатора высокого содержания возникают по мере увеличения размера выборки для изучения вопросов, требующих меньшего разрешения во времени. Очевидным преимуществом использования анализатора высокого содержания является возможность изображения 4 отдельных слайдов одновременно по сравнению с 1 слайдом на традиционных системах. С полным набором из 4 слайдов и 40 эмбрионов на каждом слайде, 160 эмбрионов могут быть изображены в течение нескольких часов, до тех пор, как интервал приобретения, по крайней мере 15 мин между кадрами. Другим важным преимуществом использования анализатора высокого содержания является то, что образцы полностью закрыты от любых внешних источников света, что необходимо для измерений на основе интенсивности флуоресценции. Наконец, анализатор высокого содержания, используемый в нашем исследовании, имеет 5,5-мегапиксельную камеру CMOS, которая обеспечивает щедрое поле зрения 221,87 мкм при увеличении в 60 раз. Это большее поле зрения позволило нам изображение половины эмбриона на приобретение точки.
The authors have nothing to disclose.
UD, WFM и BR поддерживаются Центром клеточного строительства, Национальным научным фондом (NSF) Научно-технический центр, в соответствии с грантовое соглашение DBI-1548297. BR также поддерживается через NSF CAREER награду, 1553695.
10 x 35mm Micro Dish | VWR | Cat #: 10799-192 | N/A |
100% grape juice concentrate | Welch's, 100% Concentrate Grape Juice | N/A | Purchase at Grocery Store |
250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth | VWR | Cat #: 10536-914 | N/A |
3" Non-Metallic Sieve No. 140 | Gilson Company | SV-165 #140 | N/A |
4 Slide Imaging Tray | Grace Biolabs | SKU: 400104 | N/A |
ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy | Fisher Scientific | Cat #: AC411255000 | N/A |
Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof | Fisher Scientific | Cat# : AC615095000 | N/A |
Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) | Fisher Scientific | Cat#: AC126961000 | N/A |
Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass | Fisher Scientific | Cat #: 50-143-782 | N/A |
Culture Well Silicone Sheet Material – 1.6mm thick | Grace Biolabs | SKU: 664273 | N/A |
DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials | Fisher Scientific | Cat #: 03-341-71A | N/A |
Embryo Collection Cage-Mini | Genesee Scientific | Cat #: 59-105 | N/A |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | Product Code: 10289651 | N/A |
Falcon 15mL Conical Centrifuge | Fisher Scientific | Cat #: 05-527-90 | N/A |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | Cat #: 14-432-22 | N/A |
Fleischmann's, Active Dry Yeast | Fleischmann's | N/A | Purchase at Grocery Store |
Grape Plates | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-133 | N/A |
Halocarbon 700 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-131 | N/A |
Heptane Glue | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 | VWR | Cat #: 55411-050 | N/A |
Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll | Fisher Scientific | Cat #: 50-998-944 | N/A |
Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy | Fisher Scientific | Cat #: NC0879005 | N/A |
Silica gel beads, desiccant ~ 2 – 5 mm | Millipore Sigma | SKU: 1077351000 | N/A |
Stainless Steel Spoon/Spatula | VWR | Cat #: 470149-044 | N/A |
W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents | Fisher Scientific | Cat #: 23-116582 | N/A |
Yeast Paste | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
EQUIPMENT | |||
Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts. |
Autoclave | N/A | N/A | Any autoclave will do fine. |
Drummond Nanoject II Microinjector. | Drummond Scientific | N/A | This is a mineral oil based injection system. |
GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
Refrigerator (4C°) | N/A | N/A | Fly media and yeast paste must be stored at (4C°). |
Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |