Presenteras här är ett protokoll till microinject och samtidigt bild flera Drosophila embryon under embryonala utvecklingen med hjälp av en tallrik-baserade, hög innehåll imager.
Moderna metoder inom kvantitativ livecellsavbildning har blivit ett viktigt verktyg för att utforska cellbiologi, genom att möjliggöra användning av statistik och beräkningsmodellering för att klassificera och jämföra biologiska processer. Även om cellodling modellsystem är bra för hög halt bildbehandling, högt genomströmning studier av cell morfologi tyder på att ex vivo kulturer är begränsade i recapitulating den morfologiska komplexiteten som finns i celler inom levande organismer. Som sådan, Det finns ett behov av en skalbar hög genomströmning modellsystem för att bilden levande celler inom en intakt organism. Beskrivs här är ett protokoll för att använda en hög innehåll bild analysator att samtidigt förvärva flera time-lapse videor av embryonala Drosophila melanogaster utveckling under syncytial blastoderm scenen. Den syncytial blastoderm har traditionellt fungerat som en stor in vivo modell för bildbehandling biologiska händelser; dock, erhålla ett betydande antal experimentella replikat för kvantitativa och hög genomströmning metoder har varit arbetsintensiva och begränsas av avbildning av ett enda embryo per experimentell upprepa. Presenteras här är en metod för att anpassa bildbehandling och microinjection metoder för att passa en hög halt bildsystem, eller någon inverterad mikroskop kan automatiserad multipunkt förvärv. Detta tillvägagångssätt möjliggör samtidig förvärv av 6-12 embryon, beroende på önskad förvärvsfaktorer, inom en enda bildbehandling session.
Under de senaste 30 åren har framsteg inom bildteknik och molekylära sonder för livecellsavbildning fört fram vår förståelse av cellens komplexitet och inre arbete. Medföljande denna framsteg inom teknik är en större tillit till användningen av ex vivo cell kultur modeller för förvärv av hög genomströmning bildframställning data. Cellodlingsmodeller ger flera fördelar, bland annat kontroll av mikroviromen genom mikrofluidiska system, och möjlighet att avbilda flera celler samtidigt, vilket möjliggör användning av kvantitativa metoder som är nödvändiga för screening med höggenomströmning 1,2. Det finns dock också betydande nackdelar som är förknippade med cellodlingsmodeller i samband med morfologiska studier, såsom tvådimensionella glas- eller plastytor som producerar förvirrande effekter på cellmorfologi och dessförordning 3,4,5. Dessa effekter kan ge falska eller vilseledande data när det gäller studier av biologiska processer som reglerar cellulär morfologi.
Även om alternativet har varit att studera cellulära morfologi i samband med en intakt organism6,få lämpliga intakt organismer underlätta hög genomströmning kvantitativa levande cell imaging på grund av svårigheter att hålla hela organismer vid liv genom ut imaging, och utmaningar i samband med avbildning inuti en stor flercelliga organism. Som ett resultat har cellbiologiska studier i intakta organismer i allmänhet fokuserat på att observera en enda organism över tiden, vilket kraftigt begränsar urvalsstorleken. Dessutom gör denna begränsning av en djur-vid-en-tid att det är svårt och kostsamt att använda live-bild av i form av en skärm och begränsar möjligheten att tillämpa kvantitativa analysverktyg eftersom antalet prover i allmänhet är för litet. Således uppstår behovet av en flercellig modellorganism som kan användas för högt innehåll baserade kvantitativa metoder.
Detta protokoll anpassar Drosophila embryot för plattan-baserade hög innehållsbildning för att generera experimentella provstorlekar stora nog för kvantitativ analys. Drosophila melanogaster är allmänt känd som den första modellen organism. Forskning med Drosophila har lett till genombrott inom cell- och molekylärbiologi, inklusive överföring av genetisk information, identifiering av cellsignaleringsvägar, och genetiska krav på embryonal utveckling7,8,9. Dessutom har Drosophila embryot använts för att utforska in vivo mikrotubuli dynamik under celluläradivision 10,11,12. Användningen av mikroinjektion för att leverera små molekyler och molekylära sonder ger tidsstyre som gör Drosophila embryonal utveckling särskilt kraftfull för att sondera cellulära processer in vivo13,14. Men genererar ett betydande antal experimentella upprepningar med en traditionell bildbehandling strategi är extremt arbetsintensiva och har begränsad användning i hög genomströmning bildskärmar och kvantitativ analys. Vår metod använder sig av en hög halt analysator vanligtvis reserverad för encellig analys och anpassar in vivo bildframställning analys i syncytium av den tidiga Drosophila embryo.
Detta protokoll användes för att samla in, skede, och microinject Drosophila embryon att utforska de mekanismer som driver morfologiska förändringar i Endoplasmic Reticulum (ER) under mitos15. Även om många studier har beskrivit den dynamiska karaktären av ER under cellcykeln16,17,18,19, har det varit svårt att jämföra effekterna av flera perturbations över tiden på ER morfologi. För att identifiera de komponenter som driver förändringar i ER morfologi över cell division, de metoder som anges i detta protokoll användes för att avkamma rollen av mikrotubuli och andra cytoskelettal faktorer på mitotiska ER omorganisation med hjälp av den kortikala syncytial division i början Drosophila embryot. Sammantaget tillgången till genetiska perturbation inom Drosophila samhället, förmågan att microinject läkemedel och molekylära sonder vid exakta tidpunkter under utvecklingen, och den billiga kostnaden för att arbeta med Drosophila gör detta tillvägagångssätt mycket mottagliga för hög genomströmning bildbaserad screening. De metoder som beskrivs här är tillämpliga för att studera en mängd olika cellulära och utvecklingsmässiga processer in vivo med hjälp av Drosophila embryot 20. Specifikt är detta protokoll väl anpassat för att studera biologiska händelser som inträffar under en längre period och inom 100 mikrometer från Drosophila embryocortex.
Det protokoll som beskrivs här är mycket mångsidig och lätt att anpassa för att studera biologiska händelser i en mängd olika stadier i Drosophila embryonala utveckling. Detta protokoll är väl lämt för att studera biologiska processer som sker under långa tidsperioder. Till exempel, studier av cellularization29,30 eller bildandet av heterokromatin domäner i Drosophila31,32 kunde dra nytta av att utnyttja de metoder som beskrivs i detta protokoll eftersom dessa processer sker under en längre tid. Dessutom kan provstorlek ökas genom att minska förstoringen för att studera frågor som kräver mindre optisk upplösning, såsom tidpunkten mellan syncytial divisioner33 eller gastrulationens varaktighet34. På samma sätt tillåter ett 20x-mål två embryon att avbildas inom ett bildplan. Metoderna i detta protokoll ger en dynamisk plattform för att ställa biologiska frågor med hjälp av embryonal utveckling som ett modellsystem för kvantitativ analys.
Det finns 3 kritiska steg i det här protokollet. Post avchorionation i 50% blekmedel är det absolut nödvändigt att embryon sköljs och torkas kraftigt 5 gånger (2.3.4). Detta steg tar bort alla överblivna små bitar av chorion. Överbliven chorion kommer att hindra synfältet när avbildning embryot. När man monterar embryona på glasöverdrag (3.5) är det viktigt att man trycker fast embryona på limmet med ett enhetligt tryck. Detta kommer att placera embryona på samma z plan. När du skär öppna mikroinjektionsnålen är det viktigt att dra tillbaka kolven omedelbart för att justera nålens flödeshastighet eller så förlorar du allt ditt injektionsmedel.
Vår studie begränsades av två faktorer. Den första faktorn var att inte ha en automatiserad segmenteringsprocess. Vi utformade en manuell segmentering skript med hjälp av MATLAB, dock; med en genetiskt kodad spindelmarkör skulle denna process kunna automatiseras. I framtiden vill vi producera CNN-RFP21, Rtln1-GFP och CNN-RFP; ReepB-GFP transgena linjer för att möjliggöra automatiserad spindel segmentering. För mer information angående vår MATLAB script och analyspipeline, se kompletterande material av Diaz et al.15. För det andra var vi också begränsas av vår förvärvsintervall på 35 s, vilket endast tillät oss att bild 6 embryon samtidigt. Ett längre förvärvsintervall skulle göra det möjligt för oss att avbilda fler embryon samtidigt. Även om drug delivery genomströmning kan öka genom att ersätta microinjection med ett permeation steg, fann vi detta vara onödigt eftersom vår provstorlek var redan begränsad av förvärv intervall.
Medan detta protokoll användes för att avbilda Drosophila embryonala utveckling, är den övergripande metoden anpassningsbar för att studera embryonal utveckling i andra flercelliga modellsystem, såsom C. elegans, Sjöborrar, och Xenopus. Embryon är extremt användbara för kvantitativ analys eftersom de enkelt synkroniseras via insamling eller befruktning. Dessutom flyttar embryon inte eller simmar bort från ett synfält, vilket gör det möjligt att använda en enkel multipunkt förvärv kapabel programvara för att producera flera videor tid förfaller för kvantitativ analys. Även om vi använde en analysator med hög halt i vår studie, kan alla inverterade mikroskop system som kan multipoint förvärv paras ihop med de metoder som avses häri.
Liknande resultat kan erhållas med hjälp av en multipoint förvärv kan inverterad confocal mikroskop; dock, fördelarna med en hög halt analysator fram som en ökar provstorlek för att studera frågor som kräver mindre upplösning i tid. En uppenbar fördel med att använda en analysator med högt innehåll är möjligheten att bild 4 separata diabilder samtidigt jämfört med 1 slide på traditionella system. Med en fullständig uppsättning av 4 diabilder och 40 embryon på varje objektglas kan 160 embryon avbildas under flera timmar, så länge förvärvsintervallet är minst 15 min mellan ramarna. En annan viktig fördel med att använda en analysator med hög halt är att proverna är helt avspärrade från eventuella externa ljuskällor, vilket är nödvändigt för fluorescensintensitetsbaserade mätningar. Slutligen, den höga innehållet analysator som används i vår studie har en 5,5-megapixel CMOS kamera som ger en generös 221,87 μm synfält vid 60x förstoring. Detta större synfält gjorde det möjligt för oss att avbilda ett halvt embryo per förvärvspunkt.
The authors have nothing to disclose.
UD, WFM och BR stöds av Center for Cellular Construction, en National Science Foundation (NSF) Science and Technology Center, enligt bidragsavtalet DBI-1548297. BR stöds också genom en NSF CAREER award, 1553695.
10 x 35mm Micro Dish | VWR | Cat #: 10799-192 | N/A |
100% grape juice concentrate | Welch's, 100% Concentrate Grape Juice | N/A | Purchase at Grocery Store |
250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth | VWR | Cat #: 10536-914 | N/A |
3" Non-Metallic Sieve No. 140 | Gilson Company | SV-165 #140 | N/A |
4 Slide Imaging Tray | Grace Biolabs | SKU: 400104 | N/A |
ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy | Fisher Scientific | Cat #: AC411255000 | N/A |
Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof | Fisher Scientific | Cat# : AC615095000 | N/A |
Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben ) | Fisher Scientific | Cat#: AC126961000 | N/A |
Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass | Fisher Scientific | Cat #: 50-143-782 | N/A |
Culture Well Silicone Sheet Material – 1.6mm thick | Grace Biolabs | SKU: 664273 | N/A |
DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials | Fisher Scientific | Cat #: 03-341-71A | N/A |
Embryo Collection Cage-Mini | Genesee Scientific | Cat #: 59-105 | N/A |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | Product Code: 10289651 | N/A |
Falcon 15mL Conical Centrifuge | Fisher Scientific | Cat #: 05-527-90 | N/A |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | Cat #: 14-432-22 | N/A |
Fleischmann's, Active Dry Yeast | Fleischmann's | N/A | Purchase at Grocery Store |
Grape Plates | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-133 | N/A |
Halocarbon 700 Oil | Genesee Scientific | Cat #: 59-131 | N/A |
Heptane Glue | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9 | VWR | Cat #: 55411-050 | N/A |
Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll | Fisher Scientific | Cat #: 50-998-944 | N/A |
Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy | Fisher Scientific | Cat #: NC0879005 | N/A |
Silica gel beads, desiccant ~ 2 – 5 mm | Millipore Sigma | SKU: 1077351000 | N/A |
Stainless Steel Spoon/Spatula | VWR | Cat #: 470149-044 | N/A |
W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents | Fisher Scientific | Cat #: 23-116582 | N/A |
Yeast Paste | REFFER TO RECIPE PREP | N/A | N/A |
EQUIPMENT | |||
Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge | Beckman Coulter | N/A | You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts. |
Autoclave | N/A | N/A | Any autoclave will do fine. |
Drummond Nanoject II Microinjector. | Drummond Scientific | N/A | This is a mineral oil based injection system. |
GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
Refrigerator (4C°) | N/A | N/A | Fly media and yeast paste must be stored at (4C°). |
Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |