बैक्टीरियल हठ पर उनके प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए रासायनिक यौगिकों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग
Summary
इस विधि पत्र में, हम ऑस्मोलाइट्स जैसे रासायनिक यौगिकों की पहचान करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग रणनीति प्रस्तुत करते हैं, जिसका बैक्टीरियल हठ पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है।
Abstract
बैक्टीरियल स्ट्रॉटर्स को एंटीबायोटिक दवाओं की उच्च सांद्रता को सहन करने की क्षमता के साथ फेनोटाइपिक वेरिएंट की एक छोटी उपजनसंख्या के रूप में परिभाषित किया जाता है। वे एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य चिंता का विषय है क्योंकि वे आवर्ती पुराने संक्रमणों से जुड़े हुए हैं। हालांकि तनाव से संबंधित तंत्र के stochastic और निर्धारक गतिशीलता हठ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है, के लिए निस्तेज राज्य से फेनोटाइपिक स्विच अंतर्निहित तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । जबकि पर्यावरण संकेतों (जैसे, कार्बन, नाइट्रोजन और ऑक्सीजन स्रोतों की कमी) द्वारा ट्रिगर हठ कारकों का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, दृढ़ता पर ओस्मोलाइट्स के प्रभावों का अभी निर्धारित किया जाना है । माइक्रोएरास (यानी, विभिन्न रसायनों से युक्त 96 अच्छी प्लेटों) का उपयोग करते हुए, हमने एस्चेरिचिया कोलाई हठ पर विभिन्न ओस्मोलाइट्स के प्रभावों को उच्च थ्रूपुट तरीके से स्पष्ट करने के लिए एक दृष्टिकोण तैयार किया है। यह दृष्टिकोण परिवर्तनकारी है क्योंकि इसे अन्य स्क्रीनिंग सरणी, जैसे दवा पैनलों और जीन नॉकआउट पुस्तकालयों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
बैक्टीरियल संस्कृतियों में कॉन्पॉर्सर कोशिकाओं की एक छोटी उपआबादी होती है जो एंटीबायोटिक दवाओं के असामान्य रूप से उच्च स्तर के लिए अस्थायी रूप से सहिष्णु होती है। सस्ट्रेटर कोशिकाएं आनुवंशिक रूप से उनके एंटीबायोटिक-संवेदनशील किलों के समान हैं, और उनके अस्तित्व को क्षणिक विकास अवरोध1के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। सस्ट्रेटर कोशिकाओं को पहले ग्लैडिस हॉबी2 द्वारा खोजा गया था लेकिन इस शब्द का उपयोग पहली बार जोसेफ बड़ा द्वारा किया गया था जब उन्होंने उन्हें पेनिसिलिन-इलाज स्टेफिलोकोकस पायोजीन्स संस्कृतियों में पहचानाथा 3। बालबान एट अल द्वारा प्रकाशित एक मौलिक अध्ययन4 ने दो कंट्रास्टर प्रकारों की खोज की: प्रकार I वेरिएंट जो मुख्य रूप से स्थिर चरण के माध्यम से पारित होने से बनते हैं, और टाइप II वेरिएंट जो घातीय विकास के दौरान लगातार उत्पन्न होते हैं। काल्डर क्लोनोजेनिक अस्तित्व परख द्वारा पता लगाया जाता है, जिसमें एंटीबायोटिक उपचार के दौरान विभिन्न अंतरालों पर संस्कृति के नमूने लिए जाते हैं, धोए जाते हैं, और जीवित कोशिकाओं को गिनने के लिए एक विशिष्ट विकास माध्यम पर चढ़ाया जाता है जो एंटीबायोटिक दवाओं के अभाव में उपनिवेश कर सकते हैं। कोशिका संस्कृति में बने रहने वालों के अस्तित्व का आकलन एक बिफेसिक किल कर्व4,5 द्वारा किया जाता है जहां प्रारंभिकघातीय क्षय एंटीबायोटिक-संवेदनशील कोशिकाओं की मौत को इंगित करता है। हालांकि, हत्या की प्रवृत्ति समय के साथ कम हो जाती है, अंततः एक पठार क्षेत्र है जो जीवित बनी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है के लिए अग्रणी ।
सस्ट्रेटर कोशिकाएं तपेदिक6, सिस्टिक फाइब्रोसिस7, कैंडिडियासिस8 और मूत्र पथ संक्रमण9जैसे विभिन्न रोगों से जुड़ी हुई हैं । अब तक परीक्षण किए गए लगभग सभी सूक्ष्मजीवों में अत्यधिक रोगजनक माइकोबैक्टीरियम तपेदिक6, स्टेफिलोकोकस ऑरियस10, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा7 और कैंडिडा एल्बिकान8 शामिल हैं। हाल के अध्ययनों में भी11, 12 , 12तक बने रहने वाले उपजनसंख्या से बहु-प्रतिरोधी म्यूटेंट के उदय का प्रमाण प्रदान कियागयाहै । इस क्षेत्र में पर्याप्त प्रयासों से पता चला है कि हठ तंत्र अत्यधिक जटिल और विविध हैं; एसओएस प्रतिक्रिया13,14,प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस)15,टॉक्सिन/एंटीटॉक्सिन (टीए) सिस्टम16,ऑटोफैगी या आत्म-पाचन 17 और पीपीजीपीपी से संबंधित कठोर प्रतिक्रिया18 से जुड़े स्टोचस्टिक और निर्धारक कारकों को संस्ट्रक गठन की सुविधा के लिए जानाजाता है।
हठ फेनोटाइप को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, बैक्टीरियल हठ पर ओस्मोलाइट्स के प्रभाव को पूरी तरह से समझ में नहीं आया है। चूंकि इष्टतम ऑस्मोटिक दबाव का रखरखाव कोशिकाओं के विकास, उचित कामकाज और अस्तित्व के लिए एक आवश्यकता है, इसलिए ऑस्मोलाइट्स का गहन अध्ययन विरोधी-संरक्षक रणनीतियों के लिए संभावित लक्ष्यों को जन्म दे सकता है। यद्यपि श्रमसाध्य, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग मेटाबोलाइट्स और अन्य रसायनों की पहचान करने के लिए एक बहुत प्रभावी दृष्टिकोण है जो हठ फेनोटाइप19,20में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इस काम में, हम अपने प्रकाशित विधि19पर चर्चा करेंगे, जहां हमने माइक्रोरैयस का उपयोग किया है, यानी, विभिन्न ओस्मोलाइट्स (जैसे, सोडियम क्लोराइड, यूरिया, सोडियम नाइट्राइट, सोडियम नाइट्रेट, पोटेशियम क्लोराइड) युक्त 96 अच्छी प्लेटें, ओस्मोलाइट्स की पहचान करने के लिए जो ई कोलाई हठ को काफी प्रभावित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
ई. कोलाई हठ पर विभिन्न रसायनों के प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए यहां वर्णित उच्च थ्रूपुट कॉन्डिर परख विकसित की गई थी। वाणिज्यिक पीएम प्लेटों के अलावा, चरण 4.2 में वर्णित माइक्रोरे को मैन्युअल रूप से बन?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस अध्ययन के दौरान ओरमैन लैब के सदस्यों को उनकी मूल्यवान जानकारी के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस अध्ययन NIH/NIAID K22AI125468 कैरियर संक्रमण पुरस्कार और ह्यूस्टन स्टार्टअप अनुदान के एक विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
Materials
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
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