Screening ad alta produttività dei composti chimici per chiarire i loro effetti sulla persistenza batterica
Summary
In questo documento di metodo, presentiamo una strategia di screening ad alta produttività per identificare composti chimici, come gli osmoliti, che hanno un impatto significativo sulla persistenza batterica.
Abstract
I persister batterici sono definiti come una piccola sottopopolazione di varianti fenotipiche con la capacità di tollerare alte concentrazioni di antibiotici. Sono un’importante preoccupazione per la salute in quanto sono stati associati a infezioni croniche ricorrenti. Sebbene le dinamiche stocastiche e deterministiche dei meccanismi legati allo stress svolgano un ruolo significativo nella persistenza, i meccanismi alla base del passaggio fenotipico da/verso lo stato di persistenza non sono completamente compresi. Mentre i fattori di persistenza innescati dai segnali ambientali (ad esempio, l’esaurimento delle fonti di carbonio, azoto e ossigeno) sono stati ampiamente studiati, gli impatti degli osmoliti sulla persistenza devono ancora essere determinati. Utilizzando microarray (cioè 96 piastre di pozzo contenenti varie sostanze chimiche), abbiamo progettato un approccio per chiarire gli effetti di vari osmoliti sulla persistenza di Escherichia coli in modo ad alta produttività. Questo approccio è trasformativo in quanto può essere facilmente adattato per altri array di screening, come pannelli di farmaci e librerie di knockout genico.
Introduction
Le colture batteriche contengono una piccola sottopopolazione di cellule persistenti che sono temporaneamente tolleranti a livelli insolitamente elevati di antibiotici. Le cellule persistenti sono geneticamente identiche ai loro parenti sensibili agli antibiotici e la loro sopravvivenza è stata attribuita all’inibizione transitoria della crescita1. Le cellule persistenti sono state scoperte per la prima volta da Gladys Hobby2, ma il termine è stato usato per la prima volta da Joseph Bigger quando le ha identificate nelle colture di Staphylococcus pyogenes trattate con penicillina3. Uno studio seminale pubblicato da Balaban et al. I persister sono rilevati da test di sopravvivenza clonogenici, in cui i campioni di coltura vengono prelevati a vari intervalli durante i trattamenti antibiotici, lavati e placcati su un tipico mezzo di crescita per contare le cellule sopravvissute che possono colonizzare in assenza di antibiotici. L’esistenza di persistenti in una coltura cellulare è valutata da una curva di uccisione bifasica4,5 in cui il decadimento esponenziale iniziale indica la morte di cellule sensibili agli antibiotici. Tuttavia, la tendenza all’uccisione diminuisce nel tempo, portando infine a una regione di altopiano che rappresenta le cellule persistenti sopravvissute.
Le cellule persistenti sono state associate a varie malattie come la tubercolosi6,la fibrosi cistica7,la candidosi8 e le infezioni del tratto urinario9. Quasi tutti i microrganismi testati finora hanno generato fenotipi persistenti, tra cui Mycobacterium tuberculosis6ad alta patogenicità, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 e Candida albicans8. Studi recenti forniscono anche prove dell’ascesa di mutanti multirrogatori dalle sottopopolazioni persistenti11,12. Notevoli sforzi in questo campo hanno rivelato che i meccanismi di persistenza sono molto complessi e diversificati; sia i fattori stocastico che deterministico associati ai sistemi di risposta SOS13,14, specie reattive dell’ossigeno (ROS)15, tossina/antitossina (TA)16, autofagia o autodigestione17 e risposta rigorosa correlata al ppGpp18 sono noti per facilitare la formazione persister.
Nonostante i significativi progressi nella comprensione del fenotipo di persistenza, gli effetti degli osmoliti sulla persistenza batterica non sono stati pienamente compresi. Poiché il mantenimento di una pressione osmotica ottimale è una necessità per la crescita delle cellule, il corretto funzionamento e la sopravvivenza, uno studio approfondito degli osmoliti potrebbe portare a potenziali obiettivi per strategie anti-persistenti. Sebbene lo screening laborioso e ad alta produttività sia un approccio molto efficace per identificare metaboliti e altre sostanze chimiche che svolgono un ruolo cruciale nel fenotipo di persistenza19,20. In questo lavoro, discuteremo il nostro metodopubblicato 19, dove abbiamo usato microarray, cioè 96 piastre di pozzo contenenti vari osmoliti (ad esempio, cloruro di sodio, urea, nitrito di sodio, nitrato di sodio, cloruro di potassio), per identificare gli osmoliti che influenzano significativamente la persistenza di E. coli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il saggio persister ad alta produttività qui descritto è stato sviluppato per chiarire gli effetti di varie sostanze chimiche sulla persistenza di E. coli. Oltre alle piastre PM commerciali, i microarray possono essere costruiti manualmente come descritto al passaggio 4.2. Inoltre, il protocollo qui presentato è flessibile e può essere utilizzato per schermare altri microarray, come pannelli antidroga e librerie cellulari, che sono in 96 formati di piastra di pozzo. Le condizioni sperimentali, compresa la fa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i membri di Orman Lab per i loro preziosi contributi durante questo studio. Questo studio è stato finanziato dal nih/NIAID K22AI125468 career transition award e da una borsa di studio per le startup dell’Università di Houston.
Materials
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
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