FLIM-FRET Mätningar av Protein-Protein interaktioner i levande bakterier.
Summary
Vi beskriver här ett protokoll för att karakterisera protein-protein interaktioner mellan två mycket-olika uttryckta proteiner i levande Pseudomonas aeruginosa med hjälp av FLIM-FRET mätningar. Protokollet omfattar bakteriestamkonstruktioner, bakteriemmobilisering, bildbehandling och dataanalysrutiner efter avbildning.
Abstract
Protein-protein interaktioner (protonpumpshämns) styr olika viktiga processer i celler. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) kombinerat med Förster resonansenergiöverföring (FRET) ger korrekt information om protonpumpshämmningar i levande celler. FLIM-FRET bygger på att mäta fluorescens livstid förfall av en FRET givare vid varje pixel av FLIM bilden, vilket ger kvantitativ och korrekt information om protonpumpshämmmare och deras rumsliga cellulära organisationer. Vi föreslår här ett detaljerat protokoll för FLIM-FRET mätningar som vi tillämpas för att övervaka protonpumpshämma i levande Pseudomonas aeruginosa i det särskilda fallet med två interagerande proteiner uttryckt med mycket olika kopia nummer för att visa kvalitet och robusthet av tekniken vid avslöjande kritiska funktioner av protonpumpshämmare. Detta protokoll beskriver i detalj alla nödvändiga steg för PPI-karakterisering – med utgångspunkt från bakteriell mutant konstruktioner upp till den slutliga analysen med hjälp av nyligen utvecklade verktyg som ger avancerade möjligheter visualisering för en enkel tolkning av komplexa FLIM-FRET data.
Introduction
Protein-protein interaktioner (protonpumpsh:er) styr olika viktiga processer i cellerna1. Rollerna för protonpumpshämmmare skiljer sig åt baserat på proteinsammansättning, affinitetsfunktioner och platser icellerna 2. Protonpumpshämmmare kan undersökas via olika tekniker3. Till exempel är co-immunoprecipitation en relativt enkel, robust och billig teknik som vanligen används verktyg för att identifiera eller bekräfta protonpumpshämmningar. Att studera protonpumpshämnare kan dock vara utmanande när de interagerande proteinerna har låga uttrycksnivåer eller när interaktionerna är övergående eller endast relevanta i specifika miljöer. Studera protonpumpshämmningar som förekommer mellan de olika enzymer av pyoverdin vägen i P. aeruginosa kräver att förtrycket av den allmänna järn-co-factored förtryckande Fur är lättad att låta uttrycket av alla proteiner i pyoverdin väg som skall uttryckas icellen 4,5,6. Denna gemensamma förordning för alla proteiner i vägen resulterar i tid uttryck i cellen förväntas främja deras interaktioner. Mångfalden i term av storlek, natur, uttrycksnivåer och antalet proteiner av denna metaboliska väg gör det svårt att studera i rekonstituerade system6. Utforska protonpumpshämmmare i deras cellulära miljö är därför avgörande för att ytterligare förstå de biologiska funktionerna hos proteiner i sitt hemland sammanhang.
Endast få metoder inklusive fluorescens tillåter att utforska protonpumpshämns i levande celler7. Bland de olika fluorescens parametrar som kan mätas, fluorescens livstid (dvs. den genomsnittliga tiden en fluorophore kvar i sitt upphetsade tillstånd innan avger en foton) är sannolikt en av de mest intressanta parametrar att utforska i levande celler. Fluorescenslivslängden för en fluorofor är mycket känslig för sin miljö och FLIM kan därför ge kemisk eller fysikalisk information angående den fluorophoreomgivningen 8. Detta inkluderar förekomsten av Förster resonans energiöverföring (FRET) som kan uppstå i närvaro av en “acceptor” av fluorescens som ligger på ett kort avstånd av en fluorescens “givare”. Energiöverföring resulterar i betydande förkortning av givaren fluorescens livstid (Figur 1A), vilket gör Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) en kraftfull metod för att utforska protein-protein interaktioner direkt i levande celler. FLIM kan dessutom ge rumslig information om var interaktionerna sker i cellerna7,8. Detta tillvägagångssätt är extremt kraftfullt för att undersöka protonpumpshämnare i situationer där märkning med fluoroforer hos de två samverkande partnerna är möjlig.
För FRET att inträffa – kritiska förhållanden på avståndet mellan två fluoroforer krävs8,9. De två fluoroforerna bör inte vara långt från varandra med mer än 10 nm. Därför måste försiktighetsåtgärder tas vid utformningen av FLIM-FRET-experiment för att säkerställa att givaren och accepteraren av fluorescens har en chans att vara placerade nära varandra i det samverkande komplexet. Även om detta kan tyckas begränsande, är det i själva verket en sann fördel som avstånd-beroende av FRET säkerställer att två märkta proteiner som genomgår FRET måste fysiskt interagera (Figur 1A). Svårigheterna att få tydliga svar om PPI i colocalization experiment (två colocalized proteiner kanske inte nödvändigtvis interagerar) är därför inte ett problem med hjälp av FLIM-FRET.
Figur 1: FLIM-FRET-analysprincip. Varje pixel av den flerdimensionella bilden FLIM-FRET innehåller information om fluorescensförfall som spelats in på just denna plats (#counts = antal upptäckta fotoner i kanalen t). (A) Den klassiska representationen av FLIM bilden är oftast en falsk-färg livstid kodad 2D bild (vänster). En minskning av givarens genomsnittliga fluorescenslivs livstid – vilket ses av en förändring i färgskalan – kan observeras i närvaro av FRET och är informativ om förekomsten av protonpumpshämmningar i detta rumsliga område. (B) Överlappning mellan givaremissionsspektrumet och acceptorabsorspekten är nödvändig för att FRET ska kunna inträffa. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Ett andra krav för FRET är att givarens emissionsspektrum och acceptorns absorptionsspektra ska överlappa8 (figur 1B). Fluorescensutexcitation av givaren bör vara på våglängder som bidrar mycket lite till direkt fluorescens excitation av acceptorn. Inte alla kombinationer av fluoroforer är möjliga och vi rekommenderar dessutom att företrädesvis använda givare med monoexponentiell fluorescens sönderfall för att underlätta FLIM-FRET tolkningar10. Flera par av fluorescens proteiner uppfyller dessa krav, inklusive den populära eGFP-mCherry par11 (för en översyn på paletten av tillgängliga fluorescerande protein FRET par se12,13).
FLIM-FRET gör det möjligt att mäta fluorescens livstid förfall av en FRET givare vid varje pixel av en FLIM bild (Figur 1A). Det finns två stora tekniker för att bestämma fluorescens livstid som skiljer sig i förvärv och analys: frekvens-domän (FD)14 och time-domän (TD). TD FLIM är mer utbredd och utförs med hjälp av en pulsad belysning i kombination med olika möjliga detekteringskonfigurationer inklusive gating methods15, streak camera16 eller time-correlated single photon counting (TCSPC)techniques 8. För både FD- och TD-tekniker mäts inte fluorescenslivslängden direkt utan kräver en analys av de uppmätta data för att uppskatta livstid(arna) eller förekomsten av interaktioner. För TCSPC-tekniker bygger den mest använda analysen på att försära sönderfallen med enstaka eller multi exponentiella funktioner med hjälp av minst kvadratiska iterativa återkonvolutioner som minimerar den viktade summan av rester.
Slutligen kan FLIM-FRET utföras både med hjälp av enstaka foton- eller multifotonexciteringar. Den senaste har flera fördelar som att minska autofluorescens och photodamage ur fokalplanet. Multiphoton excitations tillåt också en längre excitation djup om arbetar i tjocka 3D-prover8. Tvärtom är enda foton excitation oftast effektivare som två-foton absorption tvärsnitt av fluorescerande proteiner är begränsade17.
Här föreslår vi ett protokoll för FLIM-FRET mätningar av protonpumpshämmningar i levande P. aeruginosa i det särskilda fallet med två interagerande proteiner (PvdA och PvdL) uttryckt med mycket olika antal kopior för att visa kvalitet och robusthet av tekniken vid avslöjande kritiska funktioner i protonpumpshämtton. PvdA och PvdL proteiner är involverade i pyoverdine biosyntes. PvdA är en L-ornitin N5-oxygenas och syntetiserar L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine från L-ornitin genom hydroxylation (PvdA) och formylation (PvdF)18. PvdL är ett icke-ribosomal peptid syntes (NRPS) enzym som består av fyra moduler. Den första modulen katalyserar acylation av myristic syra. Den andra modulen katalyserar aktiveringen av L-Glu och dess kondens till den myristiska-coA. Sedan kondenserar den tredje modulen en L-Tyr aminosyra som sedan är omeriseras i D-Tyr. Slutligen binder den fjärde modulen en L-Dab (Diaminobutyric acid) aminosyra för att bilda den acylated tripeptide L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL är därmed ansvarig för syntesen av de tre första aminosyrorna av pyoverdin föregångaren. Interaktionen mellan PvdA-protein med PvdL är förvånande eftersom PvdL, tvärtom mot PvdI och PvdJ, inte bär en modul som är specifik för L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine. Denna interaktion tyder på att alla enzymer som ansvarar för pyoverdin föregångaren biosyntesen är ordnade i stora övergående och dynamiska multi-enzymatiska komplex19,20.
I denna rapport förklarar vi i detalj hur man konstruerar bakteriestammarna uttrycker natively de två interagerande eGFP och mCherry märkta proteiner. Vi beskriver också provberedning och förutsättningar för effektiv FLIM-FRET-cellavbildning. Slutligen föreslår vi en steg-för-steg handledning för bildanalys inklusive ett nyligen utvecklat verktyg som ger avancerade visualiseringsmöjligheter för okomplicerad tolkning av komplexa FLIM-FRET-data. Med detta betänkande vill vi övertyga inte bara äventyrliga utan de flesta biologer att FRET-FLIM är en tillgänglig och kraftfull teknik kunna ta itu med sina frågor om protonpumpshämmmare direkt i den inhemska cellulära miljön.
Protocol
Representative Results
Discussion
FLIM-FRET erbjuder några viktiga fördelar jämfört med intensitetsbaserad FRET-avbildning. Fluorescens livstid är en inneboende parameter av fluorophore. Som en följd är det inte beroende av lokala koncentrationer av fluoroforer varken på intensiteten av ljuset excitation. Fluorescenslivslängden påverkas dessutom också dåligt av foto-blekning. Det är särskilt intressant att bevisa protonpumpshämtton i celler där lokala proteiner koncentrationer kan vara mycket heterogena i hela de subcellulära fack eller …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner Dr Ludovic Richert för hans värdefulla stöd på FLIM datainsamling och för tekniskt underhåll och utveckling av FLIM setup. Detta arbete finansierades genom bidrag från Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN finansieras av Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). YM är tacksam mot Institut Universitaire de France (IUF) för stöd och ge ytterligare tid att ägnas åt forskning. IJS och JG erkänner institutet för narkotikaleveranser i Strasbourg för dess ekonomiska stöd.
Materials
| 525/50 nm band-pass filter | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm short pass filter | F75-680, AHF, Germany | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polymerase 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fiber-coupled avalanche photo-diode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm | Knitel glass | MS0011 | |
| High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Lysogeny broth (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Microscope slides (25×75mm) | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Succinate (Disodium) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, SPCM software | Becker & Hickl | ||
| Sterile inoculating loop | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligase 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC module | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
Riferimenti
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).
- Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions. Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).
- Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).
- Ringel, M. T., Brüser, T. The biosynthesis of pyoverdines. Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).
- Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization. Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).
- Cui, Y., et al. Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress. Science China Life Sciences. , (2019).
- Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. Springer Series in Chemical Physics. 111, 249-276 (2015).
- Bastiaens, P. I. H., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).
- Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).
- Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -. C., Masse, M. -. J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells. Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).
- Leray, A., et al. Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements. Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).
- Elson, D. S., et al. Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier. New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).
- Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. FLIM-FRET for Cancer Applications. Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8, 393-399 (2011).
- Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).
- Imperi, F., Visca, P. Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated ‘siderosome’. FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).
- Gasser, V., et al. In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa. Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).
- Rietsch, A., Mekalanos, J. J. Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).
- Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).
- Godet, J., Mély, Y. Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET. Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007 (2019).
- El Meshri, S. E., et al. Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation. Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).
- Becker, W. The bh TCSPC Handbook. Scanning. , 1 (2010).
- Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy. Springer Series in Chemical Physics. , 111 (2015).
- Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
- Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study. Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003 (2017).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions. Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).
- Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer. Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).
- Liu, X., et al. Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells. Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).
- Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
- Stringari, C., et al. Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).
- Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis. Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).
- Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data. Data in Brief. 30, 105401 (2020).
- Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 113, (2013).
- Li, L., Sun, H. Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging. Biochimica. 59, 216-217 (2020).
- Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing – deep learning approach. Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).
- Smith, J. T., et al. Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).
- Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging. Proceedings – International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).
