Visualisera diffusionell dynamik av guldnanroder på cellmembran med hjälp av en nanopartikel Darkfield Mikroskopi
Summary
Här visar vi användningen av traditionell mörkfältsmikroskopi för att övervaka dynamiken hos guldnanoroder (AuNRs) på cellmembranet. Placeringen och orienteringen av enskilda AuNR identifieras med ImageJ och MATLAB, och aunr:s diffusiva tillstånd kännetecknas av analys av enstaka partikelspårning.
Abstract
Att analysera nanopartiklarnas diffusionella dynamik på cellmembranet spelar en viktig roll för att bättre förstå den cellulära upptagsprocessen och ger en teoretisk grund för den rationella utformningen av nanomedicinsk leverans. SPT-analys (Single Particle Tracking) kan undersöka positionen och orienteringen av enskilda nanopartiklar på cellmembranet och avslöja deras translationella och roterande tillstånd. Här visar vi hur man använder traditionell mörkfältsmikroskopi för att övervaka dynamiken hos guldnanoroder (AuNRs) på levande cellmembran. Vi visar också hur man extraherar platsen och orienteringen för AuNRs med ImageJ och MATLAB, och hur man karakteriserar aunrs diffusiva tillstånd. Statistisk analys av hundratals partiklar visar att enstaka AuNR utför brownsk rörelse på ytan av U87 MG cellmembran. Individuell långloppsanalys visar dock att AuNR har två tydligt olika typer av rörelse tillstånd på membranet, nämligen långdistanstransport och begränsad område inneslutning. Våra SPT-metoder kan potentiellt användas för att studera ytan eller intracellulär partikeldiffusion i olika biologiska celler och kan bli ett kraftfullt verktyg för undersökningar av komplexa cellulära mekanismer.
Introduction
Dynamiken hos nanopartiklar (NPs) på membranet är nära förknippad med cellulära upptagsprocessen, vilket är viktigt för förståelsen av cellfunktioner, virus- eller bakterieinfektioner och utvecklingen av artificiella nanomedicinska leveranssystem1,2. SPT-teknik (Single Particle Tracking) är ett robust verktyg för att karakterisera de heterogena beteendena hos NPs3,4. I allmänhet är cellmembranet fluidiskt, vilket innebär att komponenter som proteiner och lipider kan röra sig i senareled i plasmamembranplanet5,6,7. Spatiotemporal komplexiteten i membran organisation och struktur kan leda till spatiotemporal heterogenitet av interaktionen mellan NPs och membran. Därför kräver direkt visualisering av rörelsen av NPs på membranet både hög rumslig och temporal upplösning.
Enpartikelspårningsmikroskopi som övervakar lokaliseringen av enskilda partiklar i levande celler med en rumslig upplösning på tiotals nanometer och en tidsupplösning av millisekunder har utvecklats väl för att studera NPs eller membranmolekylernasdynamik 8,9. Fluorescensbaserade mikroskopiska avbildningstekniker har blivit värdefulla verktyg för att observera NPs / molekyler i levande cellmiljö9,10,11,12. Till exempel har total intern reflektion fluorescensmikroskopi, som avbildar tunna lager (~ 100 nm) av provet vid substrat/ lösningsgränssnittet med hög spatiotemporal upplösning, använts i stor utsträckning i studier av membranmolekyldynamik13,14. De inneboende nackdelarna med enstaka fluorforer, såsom låg intensitet och snabb irreversibel fotoblekning minskar dock noggrannheten och varaktigheten förspårning 13. Därför har icke-fluorescerande plasmoniska NPs, som ersätter fluorescerande sonder, lockat mer och mer uppmärksamhet i långsiktiga avbildningsstudier på grund av deras unika optiska egenskaper15. Baserat på spridningssignalerna från plasmoniska NP-sonder har flera typer av optisk mikroskopisk bildteknik använts för att studera mekanismen för biologiska processer, såsom mörkfältsmikroskopi (DFM)16, interferometrisk spridning (iSCAT)mikroskopi 17 och differentiell interferenskontrastmikroskopi (DICM)18. Dessutom kan rörelse- och rotationsdynamiken hos AuNR erhållas med DFM och DICM18,19,20,21,22. Vanligtvis registreras objektets rörelse av det optiska mikroskopet i ett SPT-experiment och analyseras sedan med SPT-analysmetoder3. De tidsavgjorda banorna och orienteringsvinklarna som genereras av enskilda NPs är normalt stokastiska och heterogena, så det är nödvändigt att presentera riklig dynamisk information med olika analysmetoder.
Här tillhandahåller vi ett integrerat protokoll som övervakar dynamiken hos AuNRs på cellmembran med DFM, extraherar placeringen och orienteringen av AuNRs med ImageJ och MATLAB och karakteriserar spridningen av AuNRs med SPT-analysmetoder. Som en demonstration visar vi här hur man använder SPT-protokollet för att visualisera dynamiken hos omodifierade aunr (CTAB-AuNRs, syntetiserade av cetyltrimethylammonium ammoniumbromidmolekyl som skyddsmedel) på U87 MG-cellmembran. Det har visat sig att CTAB-AuNRs kan adsorbera proteiner i biologisk miljö, flytta på cellmembranet och sedan komma in icellerna 2,20,22. U87 MG-cellen är den vanligaste och mest maligna tumören i centrala nervsystemet, och dess membranreceptorer uttrycks onormalt. Membranreceptorerna kan interagera med proteiner på AuNR, vilket påverkar dynamiken hos AuNRs. Vårt protokoll är allmänt tillämpligt på andra SPT-experiment inom biologiområdet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det presenterade protokollet används för att studera dynamiken hos AuNRs på cellmembran. Protokollet består av fyra delar, inklusive mikroskopisk avbildning, datautvinning, beräkning av dynamiska parametrar och dataanalysmetoder, och varje del är flexibel och universell. Därför finns det många möjliga framtida tillämpningar, till exempel studier av rörelse av NP-länkade membranmolekyler på membran, endocytosdynamik hos NP-märkta receptorer, dynamisk analys av intracellulära NPs och vesikelbelagda NPs-tran…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China med bidragsnummer 21425519, 91853105 och 21621003.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
Riferimenti
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson’s fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
