L’activation de la kinase ser/Thr multifonctionnelle AURKA est caractérisée par son autophosphorylation sur Thr288. Les sondes fluorescentes s’appuyant sur FRET peuvent faire la distinction entre ses états inactif et activé. Ici, nous illustrons quelques stratégies pour l’ingénierie des sondes, ainsi qu’un protocole FRET rapide pour suivre l’activation des kinases tout au long de la mitose.
Les cancers épithéliaux sont souvent caractérisés par la surexpression de la kinase Ser/Thr Aurora A/AURKA. AURKA est une protéine multifonctionnelle qui s’active lors de son autophosphorylation sur Thr288. L’abondance d’AURKA culmine dans la mitose, où elle contrôle la stabilité et la fidélité du fuseau mitotique, et l’efficacité globale de la mitose. Bien que bien caractérisé au niveau structurel, un suivi cohérent de l’activation d’AURKA tout au long du cycle cellulaire fait défaut. Une solution possible consiste à utiliser des biocapteurs fret (Resonance Energy Transfer) de Förster génétiquement codés pour mieux comprendre l’autophosphorylation d’AURKA avec une résolution spatio-temporelle suffisante. Ici, nous décrivons un protocole pour concevoir des biocapteurs FRET détectant l’autophosphorylation Thr288, et comment suivre cette modification pendant la mitose. Tout d’abord, nous fournissons un aperçu des paires FRET donneur/accepteur possibles, et nous montrons les méthodes possibles de clonage et d’insertion des biocapteurs AURKA FRET dans les cellules de mammifères. Ensuite, nous fournissons une analyse étape par étape pour des mesures FRET rapides par microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM) sur une configuration personnalisée. Cependant, ce protocole est également applicable aux solutions commerciales alternatives disponibles. Nous concluons en considérant les contrôles FRET les plus appropriés pour un biocapteur à base d’AURKA, et en soulignant les améliorations futures potentielles pour augmenter encore la sensibilité de cet outil.
Aurora kinase A/AURKA est une sérine/thréonine kinase multifonctionnelle, active tout au long du cycle cellulaire et dans différents compartiments subcellulaires1. Comprendre son activation spatio-temporelle généralisée est particulièrement important dans le cancer, car AURKA est souvent surexprimé dans les tumeurs malignes épithéliales et hématologiques, les patients montrant une faible réactivité aux thérapies actuellement disponibles2.
Des études structurales ont révélé que l’AURKA subit deux étapes pour passer d’une kinase inactive à une kinase active. Tout d’abord, l’autophosphorylation de Thr288 modifie la conformation de la poche cinétique de la kinase et l’active3,4,5,6. Cette étape augmente l’activité catalytique d’AURKA dans les cellules humaines et chez Xenopus laevis3,6,7, amorçant la kinase pour une activité complète. Une fois activée, l’interaction d’AURKA avec la protéine de ciblage de Xklp2 (TPX2) induit un second changement conformationnel5. Cette modification supplémentaire permet à AURKA d’atteindre une activité enzymatique complète vers ses substrats dans la cellule5,8,9,10.
Pendant près de deux décennies, les connaissances sur l’activation et l’activité d’AURKA ont été obtenues principalement grâce à une combinaison d’approches biochimiques. Il s’agit notamment de la détection de Thr288 phosphorylé dans des cellules ou in vivo comme caractéristique de l’activation d’AURKA, d’analyses cristallographiques et de tests in vitro ou dans des tests de cellulo kinase pour sonder l’activité d’AURKA1. Cependant, la résolution spatio-temporelle de ces approches est faible ou absente, et de nouvelles solutions étaient nécessaires pour élargir les connaissances sur la dynamique de ces deux événements.
Le développement de sondes fluorescentes au cours des dernières années a facilité la surveillance d’AURKA dans les cellules vivantes, permettant le suivi de son activation avec une plus grande résolution spatio-temporelle. Les capteurs les plus spécifiques pour AURKA développés jusqu’à présent s’appuient sur le principe FRET (Förster’s Resonance Energy Transfer)11 pour faire la distinction entre AURKA inactif et actif. Le premier capteur développé était un biocapteur à base de substrat de l’activité de la kinase AURKA. Les biocapteurs à base de substrat sont constitués d’une courte séquence aminoacide ciblée par une kinase donnée pour la phosphorylation, et insérés dans une paire FRET donneur/accepteur et un domaine de liaison reconnaissant le résidu phosphorylé, ce qui aide au repliement du biocapteur pour un processus FRET efficace12. Dans le cas d’AURKA, un fragment de 14 acides aminés de KIF2C ciblé par phosphorylation a été inséré entre une paire donneur/accepteur CFP-YFP13. Cependant, ce capteur présente des inconvénients majeurs. Tout d’abord, la séquence KIF2C utilisée dans cette sonde peut être ciblée à la fois par AURKA et par la kinase étroitement apparentée AURKB, diminuant ainsi la spécificité de ce biocapteur. Deuxièmement, le capteur s’appuie sur la kinase endogène pour la phosphorylation. Par conséquent, l’efficacité fret peut être indétectable ou non significative si les quantités de kinase sont limitatives (par exemple, dans les compartiments subcellulaires ou les phases du cycle cellulaire). Pour surmonter ces limitations, une nouvelle classe de capteurs AURKA a été créée connue sous le nom de « capteurs conformationnels ». Dans ces sondes, la séquence complète d’AURKA a été insérée dans un fluorophore donneur à la terminaison N et un fluorophore accepteur à la terminaison C. AURKA inactif présente une conformation « ouverte », qui éloigne les termini N et C de la kinase l’un de l’autre. Avec une telle distance entre les deux termini (> 10 nm), la paire donneur/accepteur est dans une configuration non permissive pour FRET. Au contraire, l’AURKA autophosphorylé adopte une conformation « fermée », avec les deux protéines termini et les deux fluorophores à proximité. Il a été démontré que cela permettait le FRET entre le donneur et l’accepteur, qui peut être mesuré en utilisant les variations de la durée de vie du donneur14,15. De telles sondes présentent plusieurs avantages. Tout d’abord, ils sont génétiquement codés et peuvent être utilisés pour remplacer la kinase endogène dans la cellule. Deuxièmement, ils sauvent les phénotypes induits par l’élimination d’AURKA, indiquant qu’ils sont fonctionnels dans la cellule. Troisièmement, ils permettent de suivre l’activation de la kinase dans différents compartiments subcellulaires et tout au long du cycle cellulaire. Les sondes ont détecté l’activation d’AURKA à des endroits où la kinase est connue pour être activée (c’est-à-dire les centrosomes et le fuseau mitotique), et ont également participé à la découverte de l’activation d’AURKA au niveau des mitochondries16. Enfin, ces capteurs ont permis des criblages à haute teneur basés sur FRET/FLIM, où les changements conformationnels d’AURKA ont été utilisés pour identifier de nouveaux inhibiteurs pharmacologiques17.
Dans le présent travail, nous décrivons une procédure pour visualiser l’activation d’AURKA dans des cellules cultivées. Tout d’abord, nous allons faire un aperçu des paires de fluorophores potentielles pour FRET. Le choix de la paire donneur/accepteur la plus appropriée se fera en fonction de la configuration de microscope disponible, ou d’une application en aval particulière comme multiplex FRET18,19. Ensuite, nous proposons un pipeline pour explorer le comportement du ou des biocapteurs choisis dans une configuration de microscope FRET/FLIM rapide. Ce pipeline s’étendra des procédures de culture cellulaire et de synchronisation à l’acquisition FLIM et à l’analyse de données. Enfin, nous discuterons des avantages potentiels de ce protocole, car une stratégie analogue pour la conception de biocapteurs pourrait être appliquée à d’autres kinases, et elle pourrait également être utilisée avec d’autres systèmes d’imagerie basés sur FRET.
Les biocapteurs FRET génétiquement codés sont des outils fiables pour mesurer l’activation de protéines uniques ou de voies de signalisation entières41. En particulier, le biocapteur AURKA FRET constitue un moyen préférentiel d’explorer l’activation de la kinase dans le temps et l’espace. Cependant, certains éléments méritent une attention particulière lors de la conception ou de l’optimisation d’un biocapteur FRET, non seulement en termes généraux, mais plus spécifiquement pour AURKA.
Tout d’abord, la nature et la position relative de la paire FRET donneur/accepteur peuvent être adaptées à des fonctions spécifiques de cette kinase. AURKA est grandement enrichi au fuseau mitotique pendant la mitose, mais il est présent tout au long du cycle cellulaire et à différents endroits subcellulaires (par exemple, les centrosomes, le noyau et les mitochondries)1,2. Si le biocapteur doit être utilisé dans des compartiments spécifiques comme les mitochondries, qui peuvent atteindre un pH acide, le choix d’une paire FRET donneur-accepteur insensible au pH comme mTurquoise2/shadowG doit être fait. De plus, placer le donneur FRET au terminus C pourrait permettre une meilleure visualisation du biocapteur dans ce compartiment subcellulaire, et potentiellement même optimiser la détection FRET étant donné qu’il a été démontré que AURKA N-terminus se clivait partiellement au niveau des mitochondries16,42.
Deuxièmement, une façon encore inexplorée d’optimiser le biocapteur AURKA FRET nécessiterait une conception plus minutieuse des liants entre AURKA pleine longueur et la paire donneur/accepteur. Non seulement la distance entre la paire fluorescente, mais aussi les propriétés de l’agent de liaison lui-même se sont révélées être des facteurs clés pour améliorer l’efficacité FRET43,44,45,46. Dans cette optique, l’augmentation de la rigidité ou de la flexibilité de l’éditeur de liaison pourrait soit nuire à l’efficacité fret, soit l’améliorer davantage.
Troisièmement, on sait que la surexpression d’AURKA induit des anomalies du fuseau mitotique dans une proportion importante de cellules2. Il serait intéressant de comparer ΔLifetime obtenu en exprimant la même construction FRET sous un promoteur fort comme le cytomégalovirus (CMV) – l’un des promoteurs les plus courants trouvés dans les vecteurs d’expression des mammifères – ou sous la séquence de promoteur minimal AURKA (CTTCCGG)14,47. Il a déjà été démontré que ce promoteur sauve les fuseaux monopolaires ou multipolaires survenant après l’élimination de la kinase, et son utilisation n’a pas induit de perturbations du cycle cellulaire en soi14,47. Bien que FLIM soit insensible aux niveaux d’expression des protéines et aux concentrations relatives dans la cellule11, bénéficier d’une comparaison approfondie des deux promoteurs sur la même configuration de biocapteurs élargirait la compréhension du pool d’AURKA activé à un endroit donné. En outre, il fournirait de nouvelles informations sur la façon dont l’activation d’AURKA peut changer lors de la surexpression, ce qui est pertinent pour les paradigmes du cancer épithélial et hématologique.
Enfin, l’application FRET en aval doit également être prise en compte. Une perspective future dans le domaine de l’AURKA serait de cumuler le biocapteur conformationnel kinase avec un biocapteur à base de substrat. L’analyse du comportement FRET de deux biocapteurs simultanément – un processus connu sous le nom de MULTIPLEX FRET – nécessite un accepteur sombre sur le premier biocapteur pour éviter le saignement spectral dans le deuxième canal donneur. Dans le contexte d’AURKA, cela ouvrirait la nouvelle perspective passionnante de détecter l’activation de la kinase avec le premier biocapteur, et son activité enzymatique vers un substrat donné avec le second. Les développements récents du multiplexage permettent désormais de cumuler jusqu’à trois biocapteurs à la fois48. L’application d’une méthode similaire dans le contexte d’AURKA pourrait représenter une stratégie très prometteuse non seulement pour tester l’interaction activation-activité de la kinase, mais aussi pour explorer les cascades de signalisation AURKA avec une résolution spatio-temporelle sans précédent.
En conclusion, FRET/FLIM est un moyen pratique d’approfondir les connaissances sur l’activité des protéines. D’une part, il permet de visualiser la localisation d’une protéine donnée dans des cellules vivantes, grâce à au moins une fraction fluorescente. D’autre part, il peut démêler les changements conformationnels des protéines, ce qui pourrait être informatif sur l’activation et / ou l’activité des protéines. Par conséquent, fret/FLIM et les biocapteurs fret conformationnels ont le potentiel de devenir des méthodes répandues pour suivre les voies de signalisation dans les cellules vivantes, et avec une résolution spatio-temporelle exquise.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les ingénieurs du Centre d’Imagerie Microscopie-Rennes (MRic, BIOSIT, Rennes, France) pour leurs conseils et leur aide, et en particulier X. Pinson pour la lecture critique du manuscrit. MRic est membre de l’infrastructure nationale France-BioImagerie soutenue par l’Agence nationale de la recherche Français (ANR-10-INBS-04). Ces travaux ont été soutenus par le Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), la Ligue Contre le Cancer Comités d’Ille et Vilaine, des Côtes d’Armor et du Finistère, et l’Association pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) à G.B.
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |