Die Aktivierung der multifunktionalen Ser/Thr-Kinase AURKA zeichnet sich durch ihre Autophosphorylierung auf Thr288 aus. Fluoreszierende Sonden, die auf FRET setzen, können zwischen inaktivem und aktiviertem Zustand unterscheiden. Hier veranschaulichen wir einige Strategien für das Sonden-Engineering, zusammen mit einem schnellen FRET-Protokoll, um die Kinase-Aktivierung während der mitose zu verfolgen.
Epithelkarzinome sind oft durch die Überexpression der Ser/Thr-Kinase Aurora A/AURKA gekennzeichnet. AURKA ist ein multifunktionales Protein, das bei seiner Autophosphorylierung auf Thr288 aktiviert wird. AURKA-Häufigkeit erreicht ihren Höhepunkt in der Mitose, wo es die Stabilität und die Treue der mitotischen Spindel und die Gesamteffizienz der Mitose steuert. Obwohl auf struktureller Ebene gut charakterisiert, fehlt eine konsistente Überwachung der Aktivierung von AURKA während des gesamten Zellzyklus. Eine mögliche Lösung besteht darin, mit hilfe von genetisch kodierten Förster’s Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensoren Einblicke in die Autophosphorylierung von AURKA mit ausreichender raumzeitlicher Auflösung zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Entwicklung von FRET-Biosensoren, die die Thr288-Autophosphorylierung erkennen, und wie diese Modifikation während der Mitose zu verfolgen ist. Zunächst geben wir einen Überblick über mögliche Donor/Akzeptor-FRET-Paare und zeigen mögliche Klonierungs- und Insertionsmethoden von AURKA FRET-Biosensoren in Säugetierzellen auf. Anschließend bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Analyse für schnelle FRET-Messungen durch Fluoreszenz-Lifetime-Imaging-Mikroskopie (FLIM) in einem speziell angefertigten Setup. Dieses Protokoll ist jedoch auch auf alternative kommerzielle Lösungen anwendbar. Abschließend betrachten wir die am besten geeigneten FRET-Kontrollen für einen AURKA-basierten Biosensor und heben mögliche zukünftige Verbesserungen hervor, um die Empfindlichkeit dieses Werkzeugs weiter zu erhöhen.
Die Aurora-Kinase A/AURKA ist eine multifunktionale Serin/Threonin-Kinase, die während des gesamten Zellzyklus und in verschiedenen subzellulären Kompartimenten aktiv ist1. Das Verständnis seiner breiten räumlich-zeitlichen Aktivierung ist bei Krebs besonders wichtig, da AURKA bei epithelialen und hämatologischen Malignomen häufig überexprimiert wird und die Patienten schlecht auf die derzeit verfügbaren Therapien ansprechen2.
Strukturstudien zeigten, dass AURKA zwei Schritte durchläuft, um sich von einer inaktiven in eine aktive Kinase umzuwandeln. Erstens verändert die Autophosphorylierung von Thr288 die Konformation der kinetischen Tasche der Kinase und aktiviert sie3,4,5,6. Dieser Schritt erhöht die katalytische Aktivität von AURKA in menschlichen Zellen und in Xenopus laevis3,6,7 und bereitet die Kinase auf volle Aktivität vor. Einmal aktiviert, induziert die Interaktion von AURKA mit dem Zielprotein für Xklp2 (TPX2) eine zweite Konformationsänderung5. Diese weitere Modifikation ermöglicht es AURKA, die volle enzymatische Aktivität gegenüber seinen Substraten in der Zelle zu erreichen5,8,9,10.
Fast zwei Jahrzehnte lang wurden Erkenntnisse über die Aktivierung und Aktivität von AURKA hauptsächlich durch eine Kombination biochemischer Ansätze gewonnen. Dazu gehören der Nachweis von phosphoryliertem Thr288 in Zellen oder in vivo als Kennzeichen der AURKA-Aktivierung, kristallographische Analysen und In-vitro- oder In-Cellulo-Kinase-Assays zur Untersuchung der Aktivität von AURKA1. Die räumlich-zeitliche Auflösung dieser Ansätze ist jedoch schlecht oder fehlt, und es waren neuartige Lösungen erforderlich, um das Wissen über die Dynamik dieser beiden Ereignisse zu erweitern.
Die Entwicklung von Fluoreszenzsonden in den letzten Jahren erleichterte die Überwachung von AURKA in lebenden Zellen, so dass die Aktivierung mit größerer raumzeitlicher Auflösung erfolgen konnte. Die bisher speziellsten Sensoren für AURKA beruhen auf dem FRET-Prinzip (Förster’s Resonance Energy Transfer)11, um zwischen inaktivem und aktivem AURKA zu unterscheiden. Der erste entwickelte Sensor war ein substratbasierter Biosensor der AURKA-Kinase-Aktivität. Substratbasierte Biosensoren werden durch eine kurze aminoskalische Sequenz konstituiert, die von einer bestimmten Kinase zur Phosphorylierung angegriffen wird, und in ein Donor/Akzeptor-FRET-Paar und eine Bindungsdomäne eingefügt, die den phosphorylierten Rückstand erkennt, was die Faltung des Biosensors für einen effizienten FRET-Prozess unterstützt12. Im Fall von AURKA wurde ein 14-Aminosäure-Fragment von KIF2C, das durch Phosphorylierung angegriffen wurde, zwischen ein CFP-YFP-Donor/Akzeptor-Paar eingefügt13. Dieser Sensor hat jedoch einige große Nachteile. Erstens kann die in dieser Sonde verwendete KIF2C-Sequenz sowohl von AURKA als auch von der eng verwandten Kinase AURKB anvisiert werden, wodurch die Spezifität dieses Biosensors verringert wird. Zweitens verlässt sich der Sensor auf die endogene Kinase für die Phosphorylierung. Daher kann die FRET-Effizienz nicht nachweisbar oder nicht signifikant sein, wenn die Mengen der Kinase begrenzt sind (z. B. in subzellulären Kompartimenten oder Zellzyklusphasen). Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde eine neue Klasse von AURKA-Sensoren entwickelt, die als “Konformationssensoren” bekannt sind. In diesen Sonden wurde die AURKA-Sequenz in voller Länge in ein Donorfluorophor am N-Terminus und ein Akzeptorfluorophor am C-Terminus eingefügt. Inaktives AURKA präsentiert eine “offene” Konformation, die die N- und C-Termini der Kinase voneinander wegbringt. Mit einem solchen Abstand zwischen den beiden Termini (> 10 nm) befindet sich das Donor/Akzeptor-Paar in einer nicht-permissiven Konfiguration für FRET. Im Gegenteil, autophosphoryliertes AURKA nimmt eine “geschlossene” Konformation an, wobei die beiden Proteintermini und die beiden Fluorophore in der Nähe liegen. Es wurde gezeigt, dass dies eine FRET zwischen dem Spender und dem Akzeptor ermöglicht, die anhand der Variationen in der Spenderlebensdauer gemessen werden kann14,15. Solche Sonden bieten mehrere Vorteile. Erstens sind sie genetisch kodiert und können verwendet werden, um die endogene Kinase in der Zelle zu ersetzen. Zweitens retten sie die Phänotypen, die durch den Knockdown von AURKA induziert werden, was darauf hindeutet, dass sie in der Zelle funktionsfähig sind. Drittens ermöglichen sie es, die Aktivierung der Kinase in verschiedenen subzellulären Kompartimenten und während des gesamten Zellzyklus zu verfolgen. Die Sonden erkannten die Aktivierung von AURKA an Stellen, an denen die Kinase bekanntermaßen aktiviert ist (d.h. Zentrosomen und die mitotische Spindel), und waren auch an der Entdeckung der Aktivierung von AURKA an den Mitochondrien beteiligt16. Schließlich ermöglichten diese Sensoren High-Content-Screenings auf der Basis von FRET/FLIM, bei denen die Konformationsänderungen von AURKA zur Identifizierung neuartiger pharmakologischer Inhibitoren verwendet wurden17.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung der AURKA-Aktivierung in kultivierten Zellen. Zunächst werden wir einen Einblick in mögliche Fluorophorpaare für FRET geben. Die Wahl des am besten geeigneten Spender/Akzeptor-Paares erfolgt entsprechend dem verfügbaren Mikroskopaufbau oder einer bestimmten nachgeschalteten Anwendung als Multiplex FRET18,19. Dann schlagen wir eine Pipeline vor, um das Verhalten der Biosensoren zu untersuchen, die in einem schnellen FRET/FLIM-Mikroskopaufbau ausgewählt wurden. Diese Pipeline wird sich von Zellkultur- und Synchronisationsverfahren bis hin zur FLIM-Erfassung und Datenanalyse erstrecken. Schließlich werden wir die potenziellen Vorteile dieses Protokolls diskutieren, da eine analoge Strategie für das Biosensordesign auf andere Kinasen angewendet werden könnte und auch mit anderen FRET-basierten Bildgebungssystemen verwendet werden kann.
Genetisch kodierte FRET-Biosensoren sind zuverlässige Werkzeuge, um die Aktivierung einzelner Proteine oder ganzer Signalwege zu messen41. Insbesondere der AURKA FRET Biosensor stellt eine bevorzugte Möglichkeit dar, die Aktivierung der Kinase in Zeit und Raum zu erforschen. Einige Elemente verdienen jedoch besondere Aufmerksamkeit bei der Entwicklung oder Optimierung eines FRET-Biosensors, nicht nur allgemein, sondern speziell für AURKA.
Erstens können die Art und die relative Position des Donor/Akzeptor-FRET-Paares für spezifische Funktionen dieser Kinase angepasst werden. AURKA ist während der Mitose an der mitotischen Spindel stark angereichert, kommt aber während des gesamten Zellzyklus und an verschiedenen subzellulären Stellen (z. B. Zentrosomen, Kern und Mitochondrien) vor)1,2. Wenn der Biosensor in bestimmten Kompartimenten wie Mitochondrien eingesetzt werden soll, die einen sauren pH-Wert erreichen können, sollte die Wahl eines pH-insensitiven Donor-Akzeptor-FRET-Paares als mTurquoise2/shadowG getroffen werden. Darüber hinaus könnte die Platzierung des FRET-Donors am C-Terminus eine bessere Visualisierung des Biosensors in diesem subzellulären Kompartiment ermöglichen und möglicherweise sogar den FRET-Nachweis optimieren, da gezeigt wurde, dass AURKA N-Terminus an Mitochondrien teilweise abspaltet16,42.
Zweitens würde eine noch unerforschte Methode zur Optimierung des AURKA FRET-Biosensors ein sorgfältigeres Design der Linker zwischen AURKA in voller Länge und dem Donor/Akzeptor-Paar erfordern. Nicht nur der Abstand zwischen dem Fluoreszenzpaar, sondern auch die Eigenschaften des Linkers selbst erwiesen sich als Schlüsselfaktoren zur Verbesserung der FRET-Effizienz43,44,45,46. Vor diesem Hintergrund könnte eine Erhöhung der Steifigkeit oder Flexibilität des Linkers entweder die FRET-Effizienz beeinträchtigen oder weiter verbessern.
Drittens ist bekannt, dass die Überexpression von AURKA bei einem signifikanten Anteil der Zellen mitotische Spindelanomalien induziert2. Es wäre interessant, die ΔLifetime zu vergleichen, die durch die Expression des gleichen FRET-Konstrukts unter einem starken Promotor wie dem Cytomegalovirus (CMV) – einem der häufigsten Promotoren in Säugetierexpressionsvektoren gefunden wird – oder unter der AURKA-Minimalpromotorsequenz (CTTCCGG)14,47. Es wurde zuvor gezeigt, dass dieser Promotor monopolare oder multipolare Spindeln rettet, die nach dem Abschlag der Kinase entstehen, und seine Verwendung induzierte per se keine Störungen des Zellzyklus14,47. Obwohl FLIM unempfindlich gegen Proteinexpressionsniveaus und relative Konzentrationen in der Zelle ist11, würde ein gründlicher Vergleich der beiden Promotoren auf demselben Biosensor-Setup das Verständnis des Pools von aktiviertem AURKA an einem bestimmten Ort erweitern. Darüber hinaus würde es neue Erkenntnisse darüber liefern, wie sich die AURKA-Aktivierung bei Überexpression ändern kann, was für epitheliale und hämatologische Krebsparadigmen relevant ist.
Schließlich sollte auch die nachgelagerte FRET-Anwendung berücksichtigt werden. Eine Zukunftsperspektive im Bereich AURKA wäre die Kumulierung des Kinase-Konformations-Biosensors mit einem substratbasierten Biosensor. Die gleichzeitige Analyse des FRET-Verhaltens von zwei Biosensoren – ein Prozess, der als Multiplex-FRET bezeichnet wird – erfordert einen dunklen Akzeptor auf dem ersten Biosensor, um ein spektrales Durchbluten im zweiten Donorkanal zu vermeiden. Im Kontext von AURKA würde dies die aufregende neue Perspektive eröffnen, die Aktivierung der Kinase mit dem ersten Biosensor und ihre enzymatische Aktivität gegenüber einem bestimmten Substrat mit dem zweiten zu erkennen. Jüngste Entwicklungen im Multiplexing erlauben es nun, bis zu drei Biosensoren gleichzeitig zu kumulieren48. Die Anwendung einer ähnlichen Methode im Kontext von AURKA könnte eine sehr vielversprechende Strategie darstellen, um nicht nur das Aktivierungs-Aktivitäts-Zusammenspiel der Kinase zu testen, sondern auch AURKA-Signalkaskaden mit beispielloser raumzeitlicher Auflösung zu erforschen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass FRET/FLIM eine bequeme Möglichkeit ist, das Wissen über die Proteinaktivität zu vertiefen. Auf der einen Seite ermöglicht es, die Lokalisation eines bestimmten Proteins in lebenden Zellen zu visualisieren, dank mindestens einer fluoreszierenden Einheit. Auf der anderen Seite kann es Proteinkonformationsänderungen entwirren, die für die Proteinaktivierung und / oder -aktivität informativ sein könnten. Daher haben FRET/FLIM- und konformationale FRET-Biosensoren das Potenzial, zu weit verbreiteten Methoden zu werden, um Signalwege in lebenden Zellen und mit exquisiter raumzeitlicher Auflösung zu verfolgen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Ingenieuren des Microscopy-Rennes Imaging Center (MRic, BIOSIT, Rennes, Frankreich) für Rat und Hilfe, insbesondere X. Pinson für die kritische Lektüre des Manuskripts. MRic ist Mitglied der nationalen Infrastruktur France-BioImaging, die von der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR-10-INBS-04) unterstützt wird. Diese Arbeit wurde vom Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), der Ligue Contre le Cancer Comités d’Ille et Vilaine, des Côtes d’Armor et du Finistère und der Association pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) zu G.B unterstützt.
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |