다기능 Ser/Th 키나아제 AURKA의 활성화는 Thr288에 대한 자가포스포틸화로 특징지입니다. 여기에서는 프로브 엔지니어링을 위한 몇 가지 전략과 미토시스 전반에 걸쳐 키나아제 활성화를 따르는 빠른 FRET 프로토콜을 설명합니다.
상피 암은 종종 Ser / Thr 키나아제 오로라 A / AURKA의 과발현에 의해 특징입니다. AURKA는 Thr288에 그것의 자기 포인질에 활성화하는 다기능 단백질입니다. AURKA는 미토시스에 있는 풍부한 봉우리, 미토틱 스핀들의 안정성 과 충실도 및 미토시스의 전반적인 효율성을 통제합니다. 구조적 수준에서 잘 특성화되었지만 세포 주기 전반에 걸쳐 AURKA의 활성화에 대한 일관된 모니터링이 부족합니다. 가능한 해결책은 유전적으로 인코딩된 Förster의 공진 에너지 전송(FRET) 바이오 센서를 사용하여 충분한 현면 해상도를 갖춘 AURKA의 자가포식에 대한 통찰력을 얻는 것으로 구성됩니다. 여기에서는 Thr288 자가 포인시립을 감지하는 FRET 바이오 센서를 설계하는 프로토콜과 미토시스 중에 이 수정을 따르는 방법에 대해 설명합니다. 첫째, 우리는 가능한 기증자 / 수용자 FRET 쌍의 개요를 제공하고, 우리는 포유류 세포에 AURKA FRET 바이오 센서의 가능한 복제 및 삽입 방법을 보여줍니다. 그런 다음 맞춤형 설정에서 형광 수명 이미징 현미경 검사법(FLIM)에 의한 신속한 FRET 측정을 위한 단계별 분석을 제공합니다. 그러나 이 프로토콜은 사용 가능한 대체 상용 솔루션에도 적용할 수 있습니다. 우리는 AURKA 기반 바이오 센서에 대한 가장 적합한 FRET 제어를 고려하고 이 도구의 감도를 더욱 높이기 위해 잠재적인 향후 개선을 강조함으로써 결론을 내립니다.
오로라 키나아제 A/AURKA는 다기능 세린/스레오닌 키나아제로 세포 주기 전반에 걸쳐 다양한 세포체 구획1에서 활동합니다. AURKA는 종종 현재 이용 가능한 치료에 가난한 반응을 보이는 환자와 함께, 상피 및 혈액학적 악성종양에서 과발현되기 때문에 그것의 광범위한 현면 활성화를 이해하는 것은 암에서 특히 중요합니다2.
구조 연구에 따르면 AURKA는 비활성 에서 활성 키나아제로 전환하는 두 단계를 거치고 있습니다. 먼저, Thr288의 자가포식은 키나아제의 운동용 포켓의 형성을 변화시키고 활성화시켜 3,4,5,6을 활성화한다. 이 단계는 인간 세포와 제노푸스 laevis3,6,7에서 AURKA의 촉매 활성을 증가시키고, 전체 활성을 위해 키나아제를 프라이밍합니다. 일단 활성화되면, Xklp2 (TPX2)에 대한 표적 단백질과 AURKA의 상호 작용은 제 2 의 형성 변화를 유도5. 이 추가 수정은 AURKA가 셀5,8,9,10의 기판을 향한 완전한 효소 활성에 도달 할 수 있게합니다.
거의 2 년 동안, AURKA의 활성화 및 활동에 대한 통찰력은 생화학적 접근의 조합을 통해 주로 얻어졌다. 이들은 AURKA1의 활동을 조사하기 위하여 AURKA 활성화, 결정분석, 및 체외 또는 셀룰로 키나제 분석의 특징으로 세포 또는 생체 내에서 인지질Thr288의 검출을 포함합니다. 그러나 이러한 접근 방식의 현수체 적 해결은 가난하거나 결석하며 이 두 사건의 역학에 대한 지식을 넓히기 위해 새로운 해결책이 필요했습니다.
지난 몇 년 동안 형광 프로브의 개발은 살아있는 세포에서 AURKA의 모니터링을 용이하게, 더 큰 현시성 해상도와 활성화의 다음을 허용. 지금까지 개발된 AURKA의 가장 구체적인 센서는 FRET 원칙(Förster의 공명 에너지 전송)11에 의존하여 비활성 및 활성 AURKA를 구분합니다. 개발된 첫 번째 센서는 AURKA 키나아제 활성의 기질 계 바이오센서였습니다. 기판 계 바이오 센서는 인산화를 위한 주어진 키나아제에 의해 표적화되고, 기증자/수용자 FRET 쌍 및 인산 잔류물을 인식하는 결합 도메인 내에 삽입되는 짧은 아미노산 서열에 의해 구성되며, 이는 효율적인 FRET 공정을 위한 생체 센서의 접기를 돕는다12. AURKA의 경우, 인산화를 표적으로 한 KIF2C의 14아미노산 단편이 CFP-YFP 기증자/수용자 쌍13 사이에 삽입되었다. 그러나 이 센서에는 몇 가지 주요 단점이 있습니다. 먼저, 이 프로브에 사용되는 KIF2C 서열은 AURKA와 밀접한 관련 키나아제 AURKB에 의해 표적으로 삼아 이 생체센서의 특이성을 감소시킬 수 있다. 둘째, 센서는 인산화를 위한 내인성 키나아제에 의존한다. 따라서, FRET 효율은 키나아제의 양이 제한되는 경우 검출할 수 없거나 중요하지 않을 수 있다(예를 들어, 세포외 구획 또는 세포 주기 상에서). 이러한 한계를 극복하기 위해 AURKA 센서의 새로운 클래스를 “변형 센서”로 만들었습니다. 이러한 프로브에서, AURKA의 전체 길이 서열은 N-종기에서 기증자 불소호레 내에 삽입되었고, C-종부에서 수용자 불소호레를 삽입했다. 비활성 AURKA는 키나아제의 N-및 C-테르미니를 서로 멀리 가져오는 “열린” 변형을 제공합니다. 두 종착기 (> 10 nm) 사이의 이러한 거리와 함께, 기증자 / 수용자 쌍은 FRET에 대한 비 허용 구성에 있습니다. 반대로, 자가포증 AURKA는 두 가지 단백질 테르미니와 두 개의 형광을 근접한 “폐쇄” 변형을 채택한다. 이것은 기증자 일생에 있는 변이를 사용하여 측정될 수 있는 기증자와 수용자 사이 FRET를 허용하는 것을 보여주었습니다14,15. 이러한 프로브는 몇 가지 장점을 제시한다. 첫째, 그들은 유전적으로 인코딩되고, 세포에 있는 내인성 키나아제를 대체하기 위하여 이용될 수 있습니다. 둘째, 그들은 AURKA의 녹다운에 의해 유도된 표현형을 구출하여 세포에서 기능하고 있음을 나타냅니다. 셋째, 상이한 세포전 구획과 세포 주기 전반에 걸쳐 키나아제의 활성화를 따를 수 있다. 프로브는 키나아제가 활성화되는 것으로 알려진 위치(즉, 센트로솜 및 미토틱 스핀들)에서 AURKA의 활성화를 검출하고 미토콘드리아16에서 AURKA의 활성화를 발견하는 데도 참여했다. 마지막으로, 이러한 센서는 FRET/FLIM을 기반으로 한 고함량 스크리닝을 허용했으며, AURKA의 형태 변화는 새로운 약리학적 억제제17을 식별하는 데 사용되었습니다.
본 작업에서, 우리는 배양 된 세포에서 AURKA 활성화를 시각화하는 절차를 설명합니다. 첫째, 우리는 FRET에 대한 잠재적 인 불소 쌍에 대한 통찰력을 만들 것입니다. 가장 적합한 기증자/수용자 쌍의 선택은 사용 가능한 현미경 설정또는 멀티플렉스 FRET18,19와 같은 특정 다운스트림 응용 프로그램에 따라 이루어집니다. 그런 다음 신속한 FRET/FLIM 현미경 설정에서 선택한 바이오 센서의 동작을 탐색하는 파이프라인을 제안합니다. 이 파이프라인은 세포 배양 및 동기화 절차에서 FLIM 수집 및 데이터 분석으로 확장됩니다. 마지막으로, 바이오센서 설계를 위한 유사 전략이 다른 키나아제에 적용될 수 있고 다른 FRET 기반 이미징 시스템과도 사용될 수 있기 때문에 이 프로토콜의 잠재적 이점에 대해 논의할 것입니다.
유전자 로코딩된 FRET 바이오 센서는 단일 단백질 또는 전체 신호 경로41의 활성화를 측정하는 신뢰할 수 있는 도구입니다. 특히, AURKA FRET 바이오 센서는 시간과 공간에서 키나아제의 활성화를 탐구하는 우대적인 방법을 구성한다. 그러나 일부 요소는 FRET 바이오 센서를 설계하거나 최적화할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다.
첫째, 기증자/수용자 FRET 쌍의 특성 및 상대적 위치는 이 키나아제의 특정 기능에 맞게 조정할 수 있다. AURKA는 미토시스 도중 미토틱 스핀들에서 크게 농축되지만, 세포 주기 전체와 다른 세포 외 위치(예를 들어, 센트루좀, 핵 및 미토콘드리아)1,2에서 존재한다. 바이오 센서가 산성 pH에 도달 할 수있는 미토콘드리아와 같은 특정 구획에서 사용되는 경우, pH 무감각 기증자 수용자 FRET 쌍의 선택은 mTurquoise2 / shadowG로 이루어져야합니다. 더욱이, C-terminus에 FRET 기증자를 배치하면 이 세포전 구획에서 바이오 센서의 더 나은 시각화를 허용할 수 있고, 잠재적으로 AURKA N-terminus가 미토콘드리아16,42에서 부분적으로 갈라지는 것으로 나타났다는 점을 감안할 때 FRET 검출을 최적화할 수 있습니다.
둘째, AURKA FRET 바이오 센서를 최적화하는 아직 미개척 된 방법은 전체 길이 AURKA와 기증자 / 수용자 쌍 사이의 링커보다 신중한 설계가 필요합니다. 형광 쌍 사이의 거리뿐만 아니라 링커 자체의 특성은 FRET 효율을 향상시키는 핵심 요소인 것으로 나타났다43,44,45,46. 이 관점에서, 링커의 강성 또는 유연성을 증가하는 것은 FRET 효율성에 해롭거나 더 향상시킬 수 있습니다.
셋째, AURKA의 과발현이 세포의 상당 비율로 미토틱 스핀들 이상을 유도하는 것으로 알려져 있다2. 포유류 발현 벡터에서 발견되는 가장 일반적인 프로모터 중 하나인 사이토메갈로바이러스(CMV)와 같은 강력한 프로모터하에서 동일한 FRET 구조를 표현하거나 AURKA 최소 프로모터 시퀀스(CTTCCGG)14,47에서 얻은 ΔLifetime을 비교하는 것은 흥미로웠습니다. 이러한 프로모터는 이전에 키나아제의 낙마 후 발생하는 단극성 또는 다극성 스핀들을 구출하는 것으로 나타났으며, 그 사용은 세포 주기 의 혼란을 유도하지 않았다. FLIM은 cell11의 단백질 발현 수준 및 상대 적 농도에 민감하지 않지만 동일한 바이오 센서 설정에서 두 프로모터를 철저히 비교하면 지정된 위치에서 활성화 된 AURKA 풀의 이해를 넓힐 수 있습니다. 또한, 상피 및 혈액성 암 패러다임과 관련된 과잉 발현시 AURKA 활성화가 어떻게 변할 수 있는지에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
마지막으로 다운스트림 FRET 응용 프로그램도 고려해야 합니다. AURKA 분야의 미래 관점은 기질 계 바이오 센서로 키나아제 형성 바이오 센서를 구성하는 것입니다. 멀티플렉스 FRET로 알려진 프로세스인 두 개의 바이오 센서의 FRET 거동을 동시에 분석하려면 제2 차 기증자 채널에서 스펙트럼출혈을 피하기 위해 제1 바이오 센서의 어두운 수용자가 필요합니다. AURKA의 맥락에서, 이것은 첫번째 biosensor를 가진 키나아제의 활성화를 검출하는 흥미진진한 새로운 관점을 열고, 두 번째와 주어진 기판을 향한 효소 활동. 멀티플렉스의 최근 개발은 이제 한 번에 최대 3개의 바이오 센서를 누적할 수 있게 해 주었습니다48. AURKA의 맥락에서 유사한 방법을 적용하면 키나아제의 활성화 활동 상호 작용을 테스트할 뿐만 아니라 전례 없는 현면 해상도를 가진 AURKA 신호 캐스케이드를 탐색하는 매우 유망한 전략을 나타낼 수 있습니다.
결론적으로, FRET/FLIM은 단백질 활성에 대한 지식을 심화하는 편리한 방법입니다. 한편으로는 적어도 하나의 형광 폭정 덕분에 살아있는 세포에서 주어진 단백질의 국소화를 시각화 할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 그것은 단백질 형성 변화를 해명 할 수 있습니다., 단백질 활성화 및/또는 활동에 유익한 수 있는. 따라서 FRET/FLIM 및 형태 FRET 바이오 센서는 살아있는 세포에서 시그널링 경로를 따르고 절묘한 현수막 분해능을 따르는 광범위한 방법이 될 가능성이 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 현미경 – 렌 이미징 센터 (MRic, BIOSIT, 렌, 프랑스)의 엔지니어에게 조언과 도움을 주며, 특히 X. Pinson에게 원고의 비판적 판독에 감사드립니다. MRic은 프랑스 국립 연구 기관 (ANR-10-INBS-04)이 지원하는 국가 인프라 프랑스 – 바이오 이미징의 회원입니다. 이 작품은 센터 내셔널 드 라 레체쉬 시엔티피크 (CNRS), 리그 콘트론 르 암 코미테스 d’Ille et Vilaine, des Côtes d’Armor et du Finistère, 그리고 협회는 G에 라 레체쉬 콘트레 르 암 (ARC)을 부어 지원했다.B
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |