Aktiveringen av den multifunksjonelle Ser/Thr kinase AURKA er preget av autofosforylering på Thr288. Fluorescerende sonder som er avhengige av FRET, kan diskriminere mellom inaktive og aktiverte tilstander. Her illustrerer vi noen strategier for sondeteknikk, sammen med en rask FRET-protokoll for å følge kinaseaktiveringen gjennom mitose.
Epitelkreft er ofte preget av overekspresjon av Ser / Thr kinase Aurora A / AURKA. AURKA er et multifunksjonelt protein som aktiverer ved autofosforylering på Thr288. AURKA overflod topper i mitose, hvor det styrer stabiliteten og troskapen til den mitotiske spindelen, og den generelle effektiviteten av mitose. Selv om det er godt karakterisert på strukturelt nivå, mangler en konsistent overvåking av aktiveringen av AURKA gjennom hele cellesyklusen. En mulig løsning består i å bruke genetisk kodede Försters Resonance Energy Transfer (FRET) biosensorer for å få innsikt i autofosforylering av AURKA med tilstrekkelig romlig oppløsning. Her beskriver vi en protokoll for å konstruere FRET biosensorer som oppdager Thr288 autofosforylering, og hvordan du følger denne modifikasjonen under mitose. For det første gir vi en oversikt over mulige donor/akseptor FRET par, og vi viser mulige klonings- og innsettingsmetoder for AURKA FRET biosensorer i pattedyrceller. Deretter tilbyr vi en trinnvis analyse for raske FRET-målinger ved fluorescenslevetidsavbildningsmikroskopi (FLIM) på et spesialbygget oppsett. Denne protokollen gjelder imidlertid også for alternative kommersielle løsninger som er tilgjengelige. Vi avslutter med å vurdere de mest hensiktsmessige FRET-kontrollene for en AURKA-basert biosensor, og ved å fremheve potensielle fremtidige forbedringer for å øke følsomheten til dette verktøyet ytterligere.
Aurora kinase A/AURKA er en multifunksjonell serin/treonin kinase, aktiv gjennom hele cellesyklusen og ved forskjellige subcellulære rom1. Å forstå den brede romlige aktiveringen er spesielt viktig i kreft, da AURKA ofte er overekspressert i epitel- og hematologiske maligniteter, med pasienter som viser dårlig respons på dagens tilgjengelige terapier2.
Strukturelle studier viste at AURKA gjennomgår to trinn for å konvertere fra en inaktiv til en aktiv kinase. For det første endrer autofosforylering av Thr288 konformasjonen av kinasens kinetiske lomme og aktiverer den3,4,5,6. Dette trinnet øker den katalytiske aktiviteten til AURKA i menneskelige celler og i Xenopus laevis3,6,7, og grunner kinase for full aktivitet. Når den er aktivert, induserer samspillet mellom AURKA og målproteinet for Xklp2 (TPX2) en ny konformasjonsendring5. Denne videre modifikasjonen gjør at AURKA kan nå full enzymatisk aktivitet mot sine substrater i cellen5,8,9,10.
I nesten to tiår ble innsikt i aktivering og aktivitet av AURKA oppnådd hovedsakelig gjennom en kombinasjon av biokjemiske tilnærminger. Disse inkluderer påvisning av fosforert Thr288 i celler eller in vivo som et kjennetegn på AURKA-aktivering, krystallografiske analyser og in vitro eller i cellulo kinase analyser for å sondere aktiviteten til AURKA1. Imidlertid er den romlige oppløsningen av disse tilnærmingene dårlig eller fraværende, og nye løsninger var nødvendige for å utvide kunnskapen om dynamikken i disse to hendelsene.
Utviklingen av fluorescerende sonder de siste årene forenklet overvåkingen av AURKA i levende celler, slik at følgende aktivering med større romlig oppløsning. De mest spesifikke sensorene for AURKA utviklet så langt er avhengige av FRET-prinsippet (Förster’s Resonance Energy Transfer)11 for å diskriminere mellom inaktiv og aktiv AURKA. Den første sensoren som ble utviklet var en substratbasert biosensor av AURKA kinase aktivitet. Substratbaserte biosensorer består av en kort aminoacidisk sekvens målrettet av en gitt kinase for fosforylering, og settes inn i et donor/ akseptor FRET-par og et bindende domene som gjenkjenner fosforylerte rester, noe som hjelper folding av biosensoren for en effektiv FRET-prosess12. Når det gjelder AURKA, ble et 14-aminoacid fragment av KIF2C målrettet av fosforylering satt inn mellom en CFP-YFP donor / akseptorpar13. Denne sensoren har imidlertid noen store ulemper. For det første kan KIF2C-sekvensen som brukes i denne sonden målrettes både av AURKA og den nært beslektede kinase AURKB, og dermed redusere spesifisiteten til denne biosensoren. For det andre er sensoren avhengig av endogene kinase for fosforylering. Derfor kan FRET-effektiviteten være uoppdagelig eller ikke signifikant hvis mengden av kinasen begrenser (f.eks. i subcellulære rom eller cellesyklusfaser). For å overvinne disse begrensningene ble en ny klasse AURKA-sensor opprettet kjent som “konformasjonssensorer”. I disse sondene ble sekvensen av AURKA i full lengde satt inn i en donorfluofor ved N-terminus, og en akseptorfluofor ved C-terminus. Inaktiv AURKA presenterer en “åpen” konformasjon, som bringer kinasens N- og C-termini bort fra hverandre. Med en slik avstand mellom de to terminiene (> 10 nm) er donor/akseptorparet i en ikke-tillatt konfigurasjon for FRET. Tvert imot vedtar autofosforert AURKA en “lukket” konformasjon, med de to protein termini og de to fluoroforene i nærheten. Dette viste seg å tillate FRET mellom giveren og akseptoren, som kan måles ved hjelp av variasjonene i donorlevetiden14,15. Slike sonder presenterer flere fordeler. For det første er de genetisk kodet, og de kan brukes til å erstatte den endogene kinasen i cellen. For det andre redder de fenotypene som er indusert av nedslag av AURKA, noe som indikerer at de er funksjonelle i cellen. For det tredje tillater de å følge aktiveringen av kinase ved forskjellige subcellulære rom og gjennom hele cellesyklusen. Sondene oppdaget aktiveringen av AURKA på steder der kinase er kjent for å være aktivert (dvs. sentrosomer og den mititotiske spindelen), og deltok også i å oppdage aktiveringen av AURKA ved mitokondriene16. Til slutt tillot disse sensorene screeninger med høyt innhold basert på FRET/FLIM, der konformasjonsendringene til AURKA ble brukt til å identifisere nye farmakologiske hemmere17.
I det nåværende arbeidet beskriver vi en prosedyre for å visualisere AURKA-aktivering i dyrkede celler. Først vil vi gi et innblikk i potensielle fluoroforpar for FRET. Valget av det mest passende donor/akseptorparet vil bli gjort i henhold til det tilgjengelige mikroskopoppsettet, eller en bestemt nedstrømsapplikasjon som multiplex FRET18,19. Deretter foreslår vi en rørledning for å utforske oppførselen til biosensoren (e) som er valgt i et raskt FRET / FLIM mikroskopoppsett. Denne rørledningen vil strekke seg fra cellekultur og synkroniseringsprosedyrer til FLIM-innsamling og dataanalyse. Til slutt vil vi diskutere de potensielle fordelene ved denne protokollen, da en analog strategi for biosensordesign kan brukes på andre kinaser, og den kan også brukes med andre FRET-baserte bildesystemer.
Genetisk kodede FRET biosensorer er pålitelige verktøy for å måle aktivering av enkeltproteiner eller hele signalveier41. Spesielt utgjør AURKA FRET biosensor en fortrinnsrett måte å utforske aktiveringen av kinase i tid og rom. Noen elementer fortjener imidlertid spesiell oppmerksomhet når du designer eller optimaliserer en FRET biosensor, ikke bare generelt, men mer spesifikt for AURKA.
For det første kan donor/akseptor FRET-parets natur og relative posisjon tilpasses for spesifikke funksjoner i denne kinase. AURKA er sterkt beriket ved den mititotiske spindelen under mitose, men den er til stede gjennom hele cellesyklusen og på forskjellige subcellulære steder (f.eks. sentrosomer, kjernen og mitokondriene) 1,2. Hvis biosensoren skal brukes i spesifikke rom som mitokondrier, som kan nå sur pH, bør valget av et pH-ufølsomt donor-akseptor FRET-par som mTurquoise2 / shadowG gjøres. Videre kan plassering av FRET-donoren ved C-terminus tillate en bedre visualisering av biosensoren ved dette subcellulære rommet, og potensielt til og med optimalisere FRET-deteksjon gitt at AURKA N-terminus ble vist å delvis spalte av ved mitokondrier16,42.
For det andre vil en ennå uutforsket måte å optimalisere AURKA FRET biosensor kreve en mer forsiktig design av linkers mellom full lengde AURKA og donor / akseptorparet. Ikke bare avstanden mellom det fluorescerende paret, men også egenskapene til linkeren selv viste seg å være nøkkelfaktorer for å forbedre FRET-effektiviteten43,44,45,46. I dette lyset kan det å øke stivheten eller fleksibiliteten til koblingen enten være skadelig for FRET-effektiviteten, eller forbedre den ytterligere.
For det tredje er det kjent at overekspressjonen av AURKA induserer mititotiske spindelavvik i en betydelig andel av cellene2. Det ville være interessant å sammenligne ΔLifetime oppnådd ved å uttrykke den samme FRET-konstruksjonen under en sterk promotor som cytomegalovirus (CMV) – en av de vanligste promotørene som finnes i pattedyruttrykksvektorer – eller under AURKA minimal promotorsekvens (CTTCCGG) 14,47. Denne promotoren ble tidligere vist å redde monopol eller multipolare spindler som oppsto etter nedslag av kinase, og bruken induserte ikke cellesyklusperturbasjoner per se14,47. Selv om FLIM er ufølsom for proteinuttrykksnivåer og relative konsentrasjoner i celle11, vil det å dra nytte av en grundig sammenligning av de to promotorene på samme biosensoroppsett utvide forståelsen av bassenget med aktivert AURKA til enhver tid. I tillegg vil det gi ny innsikt i hvordan AURKA-aktivering kan endres ved overekspression, noe som er relevant for epitel- og hematologiske kreftparadigmer.
Til slutt bør også nedstrøms FRET-applikasjonen tas i betraktning. Et fremtidig perspektiv innen AURKA ville være å kumulere kinase konformasjonsbiosensoren med en substratbasert biosensor. Å analysere FRET-oppførselen til to biosensorer samtidig – en prosess kjent som multiplex FRET – krever en mørk akseptor på den første biosensoren for å unngå spektralblødning gjennom i den andre giverkanalen. I sammenheng med AURKA ville dette åpne opp det spennende nye perspektivet for å oppdage aktiveringen av kinase med den første biosensoren, og dens enzymatiske aktivitet mot et gitt substrat med den andre. Den siste utviklingen i multipleksing gjør det nå mulig å kumulere opptil tre biosensorer om gangen48. Å bruke en lignende metode i sammenheng med AURKA kan representere en svært lovende strategi, ikke bare for å teste kinasens aktiveringsaktivitetsinterplay, men også for å utforske AURKA-signalkaskader med enestående romlig løsning.
Avslutningsvis er FRET/FLIM en praktisk måte å utdype kunnskapen om proteinaktivitet på. På den ene siden gjør det mulig å visualisere lokaliseringen av et gitt protein i levende celler, takket være minst en fluorescerende moiety. På den annen side kan det avdekke proteinkonformasjonsendringer, noe som kan være informativt om proteinaktivering og / eller aktivitet. Derfor har FRET / FLIM og konforme FRET biosensorer potensial til å bli utbredte metoder for å følge signalveier i levende celler, og med utsøkt romlig oppløsning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker ingeniørene ved Microscopy-Rennes Imaging Center (MRic, BIOSIT, Rennes, France) for råd og hjelp, og spesielt X. Pinson for kritisk lesning av manuskriptet. MRic er medlem av den nasjonale infrastrukturen France-BioImaging støttet av Det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR-10-INBS-04). Dette arbeidet ble støttet av Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ligue Contre le Cancer Comités d’Ille et Vilaine, des Côtes d’Armor et du Finistère, og Foreningen pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) til G.B.
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |