Активация многофункциональной Ser/Thr киназы AURKA характеризуется ее автофосфорилированием на Thr288. Флуоресцентные зонды, полагающиеся на FRET, могут различать его неактивные и активированные состояния. Здесь мы иллюстрируем некоторые стратегии для разработки зондов вместе с быстрым протоколом FRET для отслеживания активации киназы на протяжении всего митоза.
Эпителиальный рак часто характеризуется гиперэкспрессией Ser/Thr киназы Aurora A/AURKA. AURKA – это многофункциональный белок, который активируется при его аутофосфорилировании на Thr288. Обилие AURKA достигает пика в митозе, где оно контролирует стабильность и точность митотического веретена, а также общую эффективность митоза. Несмотря на то, что он хорошо характеризуется на структурном уровне, последовательный мониторинг активации АУРКА на протяжении всего клеточного цикла отсутствует. Возможное решение заключается в использовании генетически закодированных биосенсоров резонансного переноса энергии (FRET) Фёрстера для получения представления об автофосфорилировании AURKA с достаточным пространственно-временным разрешением. Здесь мы описываем протокол разработки биосенсоров FRET, обнаруживающих автофосфорилирование Thr288, и как следить за этой модификацией во время митоза. Во-первых, мы предоставляем обзор возможных пар донор/акцептор FRET, а также показываем возможные методы клонирования и введения биосенсоров AURKA FRET в клетки млекопитающих. Затем мы предоставляем пошаговый анализ для быстрых измерений FRET с помощью флуоресцентной пожизненной визуализационной микроскопии (FLIM) на специально разработанной установке. Однако этот протокол также применим к альтернативным коммерческим решениям. В заключение мы рассмотрим наиболее подходящие элементы управления FRET для биосенсора на основе AURKA и выделим потенциальные будущие улучшения для дальнейшего повышения чувствительности этого инструмента.
Aurora kinase A/AURKA представляет собой многофункциональную серин/треонинкиназу, активную на протяжении всего клеточного цикла и в различных субклеточных компартментах1. Понимание его широкой пространственно-временной активации особенно важно при раке, поскольку AURKA часто чрезмерно экспрессируется при эпителиальных и гематологических злокачественных новообразованиях, при этом пациенты демонстрируют плохую реакцию на доступные в настоящее время методы лечения2.
Структурные исследования показали, что AURKA проходит два этапа для преобразования из неактивной киназы в активную. Во-первых, аутофосфорилирование Thr288 изменяет конформацию кинетического кармана киназы и активирует его3,4,5,6. Этот этап повышает каталитическую активность AURKA в клетках человека и в Xenopus laevis3,6,7, подготавливая киназу к полной активности. После активации взаимодействие AURKA с целевым белком для Xklp2 (TPX2) вызывает второе конформационное изменение5. Эта дальнейшая модификация позволяет AURKA достичь полной ферментативной активности по отношению к своим субстратам в клетке5,8,9,10.
В течение почти двух десятилетий понимание активации и активности AURKA было получено в основном с помощью комбинации биохимических подходов. К ним относятся обнаружение фосфорилированного Thr288 в клетках или in vivo в качестве отличительного признака активации AURKA, кристаллографический анализ и анализы in vitro или в целлюлокиназе для исследования активности AURKA1. Однако пространственно-временное разрешение этих подходов является плохим или отсутствует, и для расширения знаний о динамике этих двух событий необходимы новые решения.
Разработка флуоресцентных зондов в последние несколько лет облегчила мониторинг AURKA в живых клетках, что позволило следить за ее активацией с большим пространственно-временным разрешением. Наиболее специфические датчики для AURKA, разработанные до сих пор, основаны на принципе FRET (Резонансная передача энергии Фёрстера)11 для различения неактивных и активных AURKA. Первым разработанным датчиком был биосенсор на основе субстрата активности киназы AURKA. Биосенсоры на основе субстрата состоят из короткой аминокислотной последовательности, на которую нацелена данная киназа для фосфорилирования, и вставлены в пару донор/акцептор FRET и связующий домен, распознающий фосфорилированный остаток, что помогает сворачиванию биосенсора для эффективного процесса FRET12. В случае AURKA 14-аминокислотный фрагмент KIF2C, нацеленный фосфорилированием, был вставлен между парой донор/акцептор CFP-YFP13. Однако этот датчик имеет некоторые существенные недостатки. Во-первых, последовательность KIF2C, используемая в этом зонде, может быть нацелена как на AURKA, так и на тесно связанную киназу AURKB, тем самым уменьшая специфичность этого биосенсора. Во-вторых, датчик полагается на эндогенную киназу для фосфорилирования. Таким образом, эффективность FRET может быть неопределяемой или незначительной, если количества киназы являются ограничивающими (например, в субклеточных компартментах или фазах клеточного цикла). Чтобы преодолеть эти ограничения, был создан новый класс датчиков AURKA, известный как «конформационные датчики». В этих зондах полноразмерная последовательность AURKA была вставлена в донорский флуорофор на N-конце и акцепторный флуорофор на C-конце. Неактивная АУРКА представляет собой «открытую» конформацию, которая уводит N- и С-термины киназы друг от друга. При таком расстоянии между двумя конечными точками (> 10 нм) пара донор/акцептор находятся в неразрешительной конфигурации для FRET. Напротив, аутофосфорилированная AURKA принимает «закрытую» конформацию, с двумя белковыми терминами и двумя флуорофорами в непосредственной близости. Было показано, что это позволяет осуществлять FRET между донором и акцептором, который может быть измерен с использованием вариаций в жизни донора14,15. Такие зонды имеют ряд преимуществ. Во-первых, они генетически закодированы, и их можно использовать для замены эндогенной киназы в клетке. Во-вторых, они спасают фенотипы, индуцированные нокдауном AURKA, указывая на то, что они функциональны в клетке. В-третьих, они позволяют следить за активацией киназы в разных субклеточных компартментах и на протяжении всего клеточного цикла. Зонды обнаружили активацию AURKA в местах, где, как известно, активируется киназа (т.е. центросомы и митотическое веретено), а также участвовали в обнаружении активации AURKA в митохондриях16. Наконец, эти датчики позволили проводить скрининг с высоким содержанием на основе FRET/FLIM, где конформационные изменения AURKA использовались для идентификации новых фармакологических ингибиторов17.
В настоящей работе описана процедура визуализации активации AURKA в культивируемых клетках. Во-первых, мы сделаем представление о потенциальных парах флуорофоров для FRET. Выбор наиболее подходящей пары донор/акцептор будет сделан в соответствии с имеющейся установкой микроскопа или конкретным последующим применением в виде мультиплекса FRET18,19. Затем мы предлагаем конвейер для изучения поведения биосенсора (биосенсоров), выбранных в быстрой настройке микроскопа FRET / FLIM. Этот конвейер будет простираться от процедур клеточной культуры и синхронизации до сбора и анализа данных FLIM. Наконец, мы обсудим потенциальные преимущества этого протокола, поскольку аналогичная стратегия для проектирования биосенсоров может быть применена к другим киназам, а также может использоваться с другими системами визуализации на основе FRET.
Генетически закодированные биосенсоры FRET являются надежными инструментами для измерения активации отдельных белков или целых сигнальных путей41. В частности, биосенсор AURKA FRET представляет собой предпочтительный способ исследования активации киназы во времени и пространстве. Однако некоторые элементы заслуживают особого внимания при проектировании или оптимизации биосенсора FRET не только в общих чертах, но и более конкретно для AURKA.
Во-первых, характер и относительное положение пары донор/акцептор FRET могут быть адаптированы под конкретные функции этой киназы. AURKA значительно обогащается в митотическом веретене во время митоза, но она присутствует на протяжении всего клеточного цикла и в разных субклеточных местах (например, центросомах, ядре и митохондриях)1,2. Если биосенсор должен использоваться в определенных отсеках, таких как митохондрии, которые могут достигать кислого рН, следует выбрать pH-нечувствительную к донору-акцептору freT пару mTurquoise2/shadowG. Более того, размещение донора FRET на C-конце может позволить лучше визуализировать биосенсор в этом субклеточном компартменте и потенциально даже оптимизировать обнаружение FRET, учитывая, что AURKA N-конец, как было показано, частично расщепляется в митохондриях16,42.
Во-вторых, еще не изученный способ оптимизации биосенсора AURKA FRET потребует более тщательного проектирования линкеров между полноразмерной AURKA и парой донор/акцептор. Было показано, что не только расстояние между флуоресцентной парой, но и свойства самого линкера являются ключевыми факторами повышения эффективности FRET43,44,45,46. В этом свете повышение жесткости или гибкости линкера может либо нанести ущерб эффективности FRET, либо еще больше улучшить ее.
В-третьих, известно, что сверхэкспрессия АУРКА вызывает митотические веретенообразные аномалии у значительной части клеток2. Было бы интересно сравнить ΔLifetime, полученный путем экспрессии той же конструкции FRET под сильным промотором, таким как цитомегаловирус (ЦМВ) – один из наиболее распространенных промоторов, обнаруженных в векторах экспрессии млекопитающих – или под последовательностью минимальных промоторов AURKA (CTTCCGG) 14,47. Ранее было показано, что этот промотор спасает монополярные или многополярные веретена, возникающие после сбития киназы, и его использование не вызывало возмущений клеточного цикла как такового14,47. Хотя FLIM нечувствителен к уровням экспрессии белка и относительным концентрациям в клетке11, получение выгоды от тщательного сравнения двух промоторов на одной и той же установке биосенсора расширит понимание пула активированной AURKA в любом заданном месте. Кроме того, это даст новое представление о том, как активация AURKA может измениться при гиперэкспрессии, что имеет отношение к парадигмам эпителиального и гематологического рака.
Наконец, следует также учитывать последующее применение FRET. Будущая перспектива в области AURKA будет заключаться в кумуляции конформационного биосенсора киназы с биосенсором на основе субстрата. Анализ поведения FRET двух биосенсоров одновременно – процесс, известный как мультиплексный FRET – требует темного акцептора на первом биосенсоре, чтобы избежать спектрального кровотечения во втором донорском канале. В контексте AURKA это открыло бы захватывающую новую перспективу обнаружения активации киназы с первым биосенсором и ее ферментативной активности по отношению к данному субстрату со вторым. Последние разработки в области мультиплексирования теперь позволяют накапливать до трех биосенсоров одновременно48. Применение аналогичного метода в контексте AURKA может представлять собой очень перспективную стратегию не только для тестирования взаимодействия активации-активности киназы, но и для изучения сигнальных каскадов AURKA с беспрецедентным пространственно-временным разрешением.
В заключение, FRET/FLIM является удобным способом углубления знаний об активности белка. С одной стороны, он позволяет визуализировать локализацию данного белка в живых клетках, благодаря хотя бы одному флуоресцентному фрагменту. С другой стороны, он может распутать конформационные изменения белка, которые могут быть информативными для активации и / или активности белка. Таким образом, биосенсоры FRET/FLIM и конформационные ФРЕТ могут стать широко распространенными методами следования сигнальным путям в живых клетках и с изысканным пространственно-временным разрешением.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим инженеров Центра визуализации Микроскопии-Ренна (MRic, BIOSIT, Ренн, Франция) за советы и помощь, и особенно X. Pinson за критическое прочтение рукописи. MRic является членом национальной инфраструктуры France-BioImaging при поддержке Французского национального исследовательского агентства (ANR-10-INBS-04). Эта работа была поддержана Национальным центром научных исследований (CNRS), Лигой по борьбе с раком, Комитетами по борьбе с раком, Бронетанковыми и финансовыми институтами и Ассоциацией по борьбе с раком (ARC) при G.B.
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |