La activación de la quinasa multifuncional Ser/Thr AURKA se caracteriza por su autofosforilación en Thr288. Las sondas fluorescentes que dependen de FRET pueden discriminar entre sus estados inactivo y activado. Aquí, ilustramos algunas estrategias para la ingeniería de sondas, junto con un protocolo FRET rápido para seguir la activación de la quinasa a lo largo de la mitosis.
Los cánceres epiteliales a menudo se caracterizan por la sobreexpresión de la Ser/Thr quinasa Aurora A/AURKA. AURKA es una proteína multifuncional que se activa tras su autofosforilación en Thr288. AURKA abundancia alcanza su punto máximo en la mitosis, donde controla la estabilidad y la fidelidad del huso mitótico, y la eficiencia general de la mitosis. Aunque bien caracterizado a nivel estructural, falta un seguimiento consistente de la activación de AURKA a lo largo del ciclo celular. Una posible solución consiste en utilizar biosensores de transferencia de energía de resonancia (FRET) de Förster codificados genéticamente para obtener información sobre la autofosforilación de AURKA con suficiente resolución espaciotemporal. Aquí, describimos un protocolo para diseñar biosensores FRET que detecten la autofosforilación Thr288 y cómo seguir esta modificación durante la mitosis. En primer lugar, proporcionamos una visión general de los posibles pares de FRET donante/aceptor, y mostramos posibles métodos de clonación e inserción de biosensores AURKA FRET en células de mamíferos. Luego, proporcionamos un análisis paso a paso para mediciones rápidas de FRET mediante microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM) en una configuración personalizada. Sin embargo, este protocolo también es aplicable a las soluciones comerciales alternativas disponibles. Concluimos considerando los controles FRET más apropiados para un biosensor basado en AURKA, y destacando posibles mejoras futuras para aumentar aún más la sensibilidad de esta herramienta.
La aurora quinasa A/AURKA es una serina/treonina quinasa multifuncional, activa durante todo el ciclo celular y en diferentes compartimentos subcelulares1. Comprender su amplia activación espaciotemporal es particularmente importante en cáncer, ya que AURKA a menudo se sobreexpresa en neoplasias epiteliales y hematológicas malignas, con pacientes que muestran poca capacidad de respuesta a las terapias actualmente disponibles2.
Los estudios estructurales revelaron que AURKA se somete a dos pasos para convertirse de una quinasa inactiva a una quinasa activa. En primer lugar, la autofosforilación de Thr288 cambia la conformación de la bolsa cinética de la quinasa y la activa3,4,5,6. Este paso aumenta la actividad catalítica de AURKA en células humanas y en Xenopus laevis3,6,7, preparando la quinasa para una actividad completa. Una vez activado, la interacción de AURKA con la proteína diana para Xklp2 (TPX2) induce un segundo cambio conformacional5. Esta modificación adicional permite a AURKA alcanzar la actividad enzimática completa hacia sus sustratos en la célula5,8,9,10.
Durante casi dos décadas, los conocimientos sobre la activación y la actividad de AURKA se obtuvieron principalmente a través de una combinación de enfoques bioquímicos. Estos incluyen la detección de Thr288 fosforilado en células o in vivo como un sello distintivo de la activación de AURKA, análisis cristalográficos y ensayos in vitro o en celuloquinasa para sondear la actividad de AURKA1. Sin embargo, la resolución espaciotemporal de estos enfoques es pobre o ausente, y se necesitaban soluciones novedosas para ampliar el conocimiento de la dinámica de estos dos eventos.
El desarrollo de sondas fluorescentes en los últimos años facilitó la monitorización de AURKA en células vivas, permitiendo el seguimiento de su activación con mayor resolución espaciotemporal. Los sensores más específicos para AURKA desarrollados hasta ahora se basan en el principio FRET (Förster’s Resonance Energy Transfer)11 para discriminar entre AURKA inactivo y activo. El primer sensor desarrollado fue un biosensor basado en sustrato de la actividad de la quinasa AURKA. Los biosensores basados en sustrato están constituidos por una secuencia aminoácida corta dirigida por una quinasa dada para la fosforilación, e insertada dentro de un par FRET donante/aceptor y un dominio de unión que reconoce el residuo fosforilado, lo que ayuda al plegamiento del biosensor para un proceso FRET eficiente12. En el caso de AURKA, se insertó un fragmento de 14 aminoácidos de KIF2C dirigido por fosforilación entre un par donante/aceptor CFP-YFP13. Sin embargo, este sensor tiene algunos inconvenientes importantes. En primer lugar, la secuencia KIF2C utilizada en esta sonda puede ser dirigida tanto por AURKA como por la quinasa estrechamente relacionada AURKB, disminuyendo así la especificidad de este biosensor. En segundo lugar, el sensor se basa en la quinasa endógena para la fosforilación. Por lo tanto, la eficiencia de FRET puede ser indetectable o no significativa si las cantidades de la quinasa son limitantes (por ejemplo, en compartimentos subcelulares o fases del ciclo celular). Para superar estas limitaciones, se creó una nueva clase de sensor AURKA conocido como “sensores conformacionales”. En estas sondas, la secuencia completa de AURKA se insertó dentro de un fluoróforo donante en el extremo N, y un fluoróforo aceptor en el extremo C. La AURKA inactiva presenta una conformación “abierta”, que aleja a los N- y C-termini de la quinasa entre sí. Con tal distancia entre los dos termini (> 10 nm), el par donante/aceptor está en una configuración no permisiva para FRET. Por el contrario, la AURKA autofosforilada adopta una conformación “cerrada”, con las dos proteínas termini y los dos fluoróforos en proximidad. Se demostró que esto permite la FRET entre el donante y el aceptor, que puede medirse utilizando las variaciones en la vida del donante14,15. Tales sondas presentan varias ventajas. Primero, están codificados genéticamente y se pueden usar para reemplazar la quinasa endógena en la célula. En segundo lugar, rescatan los fenotipos inducidos por el derribo de AURKA, lo que indica que son funcionales en la célula. En tercer lugar, permiten seguir la activación de la quinasa en diferentes compartimentos subcelulares y a lo largo del ciclo celular. Las sondas detectaron la activación de AURKA en lugares donde se sabe que la quinasa está activada (es decir, centrosomas y el huso mitótico), y también participaron en el descubrimiento de la activación de AURKA en las mitocondrias16. Por último, estos sensores permitieron cribados de alto contenido basados en FRET/FLIM, donde se utilizaron los cambios conformacionales de AURKA para identificar nuevos inhibidores farmacológicos17.
En el presente trabajo, describimos un procedimiento para visualizar la activación de AURKA en células cultivadas. Primero, haremos una idea de los posibles pares de fluoróforos para FRET. La elección del par donante/aceptor más adecuado se realizará de acuerdo con la configuración del microscopio disponible, o una aplicación posterior particular como multiplex FRET18,19. Luego, proponemos una tubería para explorar el comportamiento de los biosensores elegidos en una configuración rápida del microscopio FRET / FLIM. Esta canalización se extenderá desde el cultivo celular y los procedimientos de sincronización hasta la adquisición de FLIM y el análisis de datos. Por último, discutiremos las ventajas potenciales de este protocolo, ya que una estrategia análoga para el diseño de biosensores podría aplicarse a otras quinasas, y también se puede usar con otros sistemas de imágenes basados en FRET.
Los biosensores FRET codificados genéticamente son herramientas fiables para medir la activación de proteínas individuales o de vías de señalización completas41. En particular, el biosensor AURKA FRET constituye una forma preferente de explorar la activación de la quinasa en el tiempo y el espacio. Sin embargo, algunos elementos merecen una atención especial a la hora de diseñar u optimizar un biosensor FRET, no solo en términos generales sino más específicamente para AURKA.
En primer lugar, la naturaleza y la posición relativa del par FRET donante/aceptor se pueden adaptar para funciones específicas de esta quinasa. La AURKA se enriquece enormemente en el huso mitótico durante la mitosis, pero está presente a lo largo del ciclo celular y en diferentes ubicaciones subcelulares (por ejemplo, centrosomas, el núcleo y las mitocondrias)1,2. Si el biosensor se va a utilizar en compartimentos específicos como las mitocondrias, que pueden alcanzar un pH ácido, se debe elegir un par FRET donante-aceptor insensible al pH como mTurquoise2/shadowG. Además, la colocación del donante FRET en el extremo C podría permitir una mejor visualización del biosensor en este compartimento subcelular, y potencialmente incluso optimizar la detección de FRET dado que se demostró que AURKA N-terminal se escinde parcialmente en las mitocondrias16,42.
En segundo lugar, una forma aún inexplorada de optimizar el biosensor AURKA FRET requeriría un diseño más cuidadoso de los enlazadores entre AURKA de longitud completa y el par donante/aceptor. No solo la distancia entre el par fluorescente, sino también las propiedades del propio enlazador demostraron ser factores clave para mejorar la eficiencia de FRET43,44,45,46. En este sentido, aumentar la rigidez o la flexibilidad del enlazador podría ser perjudicial para la eficiencia de FRET o mejorarla aún más.
En tercer lugar, se sabe que la sobreexpresión de AURKA induce anomalías mitóticas del huso en una proporción significativa de células2. Sería interesante comparar el ΔLifetime obtenido expresando el mismo constructo FRET bajo un promotor fuerte como el citomegalovirus (CMV) – uno de los promotores más comunes encontrados en los vectores de expresión de mamíferos – o bajo la secuencia de promotor mínimo AURKA (CTTCCGG)14,47. Anteriormente se demostró que este promotor rescata husos monopolares o multipolares que surgen después del derribo de la quinasa, y su uso no indujo perturbaciones del ciclo celular per se14,47. Aunque FLIM es insensible a los niveles de expresión de proteínas y las concentraciones relativas en la célula11, beneficiarse de una comparación exhaustiva de los dos promotores en la misma configuración de biosensores ampliaría la comprensión del grupo de AURKA activado en cualquier lugar dado. Además, proporcionaría nuevos conocimientos sobre cómo la activación de AURKA puede cambiar tras la sobreexpresión, lo cual es relevante para los paradigmas del cáncer epitelial y hematológico.
Por último, también se debe tener en cuenta la aplicación FRET aguas abajo. Una perspectiva futura en el campo de AURKA sería acumular el biosensor conformacional de quinasa con un biosensor basado en sustrato. El análisis del comportamiento FRET de dos biosensores simultáneamente, un proceso conocido como FRET multiplex, requiere un aceptor oscuro en el primer biosensor para evitar el sangrado espectral en el segundo canal donante. En el contexto de AURKA, esto abriría la nueva y emocionante perspectiva de detectar la activación de la quinasa con el primer biosensor, y su actividad enzimática hacia un sustrato dado con el segundo. Los desarrollos recientes en multiplexación permiten ahora acumular hasta tres biosensores a la vez48. La aplicación de un método similar en el contexto de AURKA podría representar una estrategia muy prometedora no solo para probar la interacción activación-actividad de la quinasa, sino también para explorar cascadas de señalización AURKA con una resolución espaciotemporal sin precedentes.
En conclusión, FRET/FLIM es una forma conveniente de profundizar el conocimiento sobre la actividad de las proteínas. Por un lado, permite visualizar la localización de una proteína dada en células vivas, gracias a al menos una fracción fluorescente. Por otro lado, puede desentrañar los cambios conformacionales de las proteínas, lo que podría ser informativo sobre la activación y / o actividad de las proteínas. Por lo tanto, los biosensores FRET/FLIM y FRET conformacionales tienen el potencial de convertirse en métodos generalizados para seguir las vías de señalización en células vivas, y con una exquisita resolución espaciotemporal.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los ingenieros del Microscopy-Rennes Imaging Center (MRic, BIOSIT, Rennes, Francia) por su asesoramiento y ayuda, y en particular a X. Pinson por la lectura crítica del manuscrito. MRic es miembro de la infraestructura nacional France-BioImaging apoyada por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR-10-INBS-04). Este trabajo fue apoyado por el Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), la Ligue Contre le Cancer Comités d’Ille et Vilaine, des Côtes d’Armor et du Finistère, y la Association pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) a G.B.
Alisertib (MLN8237) | SelleckChem | S1133 | Use at a 250 nM final dilution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
41966052 | High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
10270106 | |
L15 | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
21083027 | Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red |
LabTek | Nunc | 2515380 | |
Nocodazole | Merck Brand: Sigma-Aldrich |
M1404 | Use at a 100 ng/mL final dilution |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
15140122 | Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x) |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
14190169 | DPBS, no calcium, no magnesium |
Trypsin/EDTA | ThermoFischer Scientific Brand: Gibco |
25300096 | Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x) |