יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

Summary

אנו מתארים שיטה ליצירת ספריות מוטציה טרנספוסון רוויבחיידקים גראם שלילי והכנה לאחר מכן של ספריות amplicon DNA להמשך תפוקה גבוהה. כדוגמה, אנו מתמקדים בפתוגן ESKAPE, Acinetobacter baumannii, אבל פרוטוקול זה הוא נוח למגוון רחב של אורגניזמים גראם שלילי.

Abstract

רצף Transposon (Tn-seq) היא שיטה רבת עוצמה המשלבת מוטאגנזה טרנספוסון ו רצף מקבילי מסיבי כדי לזהות גנים ומסלולים התורמים לכושר חיידקי במגוון רחב של תנאים סביבתיים. יישומי Tn-seq הם נרחבים ולא רק אפשרו בדיקה של יחסי גנוטיפ-פנוטיפ ברמת אורגניזם, אלא גם ברמות האוכלוסייה, הקהילה והמערכות. חיידקים גראם שלילי קשורים מאוד עם פנוטיפים עמידות מיקרוביאלית, אשר גדל תקריות של כשל טיפול אנטיביוטי. עמידות מיקרוביאלית מוגדרת כצמיחה חיידקית בנוכחות אנטיביוטיקה קטלנית אחרת. הקוליסטן מיקרוביאלי “השורה האחרונה” משמש לטיפול בזיהומים חיידקיים גראם שלילי. עם זאת, מספר פתוגנים גראם שליליים, כולל Acinetobacter baumannii יכול לפתח התנגדות קוליסטין באמצעות מגוון רחב של מנגנונים מולקולריים, שחלקם אופיין באמצעות Tn-seq. יתר על כן, נתיבי טרנס-תמרת אותות המווסתים את ההתנגדות קוליסטין להשתנות בתוך חיידקים גראם שלילי. כאן אנו מציעים שיטה יעילה של מוטאגנזה transposon ב- Baumannii מייעל הדור של ספריית הכנסה transposon רווי ובניית ספריית אמפיקון על ידי ביטול הצורך אנזימי הגבלה, קשירה מתאם, וטיהור ג’ל. השיטות המתוארות בזאת יאפשרו ניתוח מעמיק של גורמים מכריעים מולקולריים התורמים לכושר של א. באומאני כאשר הם מאותגרים עם קוליסטין. הפרוטוקול ישים גם פתוגנים אחרים ESKAPE גראם שלילי, אשר קשורים בעיקר עם זיהומים עמידים לתרופות שנרכשו על ידי בית החולים.

Introduction

הגילוי של אנטיביוטיקה הוא ללא ספק אחד האירועים המשפיעים ביותר הקשורים לבריאות של המאה ה^-20. לא רק אנטיביוטיקה במהירות לפתור זיהומים חיידקיים חמורים, הם גם לשחק תפקיד מרכזי ברפואה המודרנית. ניתוחים גדולים, השתלות והתקדמות ברפואת יילודים וכימותרפיה להשאיר חולים רגישים לזיהומים מסכני חיים וטיפולים אלה לא יהיו אפשריים ללא^{אנטיביוטיקה 1,,2}. עם זאת, התפתחות מהירה והתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה בקרב פתוגנים אנושיים הפחיתה באופן משמעותי את היעילות של כל המעמדות החשובים קלינית של^{אנטיביוטיקה 3}. זיהומים חיידקיים רבים שפעם נוקו בקלות עם טיפול באנטיביוטיקה, כבר לא מגיבים לפרוטוקולי טיפול קלאסיים, גרימת איום רציני על בריאות הציבור העולמי¹. עמידות מיקרוביאלית (AMR) היא המקום שבו תאים חיידקיים לגדול בריכוזים קטלניים אחרת של אנטיביוטיקה, ללא קשר^{למשך הטיפול 4,5}. יש צורך דחוף להבין גורמים מולקולריים וביוכימיים המווסתים AMR, אשר יסייעו להנחות התפתחות מיקרוביאלית חלופית. באופן ספציפי, פתוגנים ESKAPE הם בעייתיים בהגדרות קליניות הקשורים AMR נרחב. אלה כוללים Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella דלקתריאות , Aצ’ינטובקטר באומאני, Pseudomonas aeruginosa ו Enterobacter spp. בעוד מספר מנגנונים לתרום AMR בפתוגנים ESKAPE, ארבעת האורגניזמים האחרונים הם גראם שלילי.

חיידקים גראם שליליים להרכיב קרום חוץ מגדיר שמגן עליהם מפני תנאים סביבתיים קשים. הממברנה החוצה משמשת כמחסום חחלה כדי להגביל את הכניסה של מולקולות רעילות, כגון אנטיביוטיקה, לתוך התא. שלא כמו קרום ביולוגי אחר, הממברנה החוץ היא אסימטרית. העלון הפנימי מועשר בליפופוליסכריד החשוף לפני השטח, ואילו העלון הפנימי הוא תערובת של פוספוליפידים⁶. מולקולות Lipopolysaccharide מעוגנות קרום החוץ על ידי שומנים שומרים moiety מוטבע בתוך bilayer שומנים⁷. הליפים הקאנוניים תחום של Escherichia קולי lipopolysaccharide נדרש לצמיחה של רוב חיידקים גראם שלילי והוא מסונתז על ידי מסלול אנזימטי תשעה שלבים כי הוא אחד המסלולים הבסיסיים ביותר וconserved ב אורגניזמים גראם^{שליליים 6,,7,,8}.

פולימיקסין הם פפטידים מיקרוביאליים cationic כי היעד השימנים תחום של lipopolysaccharide כדי לפגוע קרום החוץ ולריס את התא. האינטראקציה האלקטרוסטטית בין שאריות טעונות בחיוב של פולימיקסין לבין שומנים טעונים שלילית קבוצות פוספט לשבש את קרום התא החיידקי בסופו של דבר מוביל למוות תא^{,9,10,,11,12,,13}. Colistin (polymyxin E) הוא מיקרוביאלית המוצא האחרון המשמש לטיפול בזיהומים הנגרמת על ידי פתוגנים נוסוקומיים עמידים multidrug, כגון Acinetobacter baumannii^14,15,16. התגלה לראשונה בשנת 1947, polymyxins מיוצרים על ידי חיידקי הקרקע, Paenibacillus polymyxa^17,18,19. פולימיקסין נקבעו לטיפול בזיהומים גראם שליליים במשך שנים לפני השימוש הקליני שלהם היה מוגבל בשל דיווחים של nephro משמעותית- ו neurotoxicity^20,,21.

א. באומני הוא פתוגן גראם-שלילי נוסוקומלי שהגביר באופן דרמטי את התמלומות והתמותה של תוצאות המטופל בעשורים^{האחרונים 22}. מה שנחשב בעבר פתוגן בסיכון נמוך, מהווה כעת סיכון משמעותי לזיהום שנרכש על ידי בית החולים ברחבי העולם בשל יכולתו המדהימה לרכוש AMR וסיכון גבוה^{למגפה 23,24}. א. באומאני מהווה יותר מ-10% מהזיהומים הנוזוקומיים בארה”ב. מחלה באה לידי ביטוי כמו דלקת ריאות, בקטרימיה, דלקת בדרכי השתן, עור ודלקות רקמות רכות, דלקת קרום המוח, ודלקת פנים^{הלב 25}. אפשרויות הטיפול בזיהומים A. baumannii הצטמצמו בשל התנגדות נגד כמעט כל מחלקות אנטיביוטיקה, כולל β-לקטמס, fluoroquinolones, טטרציקלין, ו aminoglycosides^23,24. השכיחות של עמידים multidrug, עמידים באופן נרחב תרופות ופאן-תרופות עמידים A. baumannii מבודד הוביל לתחייה בטיפול colistin, אשר נחשב לאחת האפשרויות הטיפוליות הבודדות שנותרו עדיין יעיל נגד multidrug עמידים A. baumannii. עם זאת, ההתנגדות הגוברת לקוליסטין בקרב מבודדים באומאני הגבירה עוד יותר את האיום שלה על בריאות הציבור^{העולמית 10,11,12,13,,27,,30,31}.^,

ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה, כגון רצף transposon (Tn-seq), סיפקו כלים חשובים כדי לקדם את ההבנה שלנו של כושר חיידקי במבחנה ו- vivo. Tn-seq הוא כלי רב עוצמה שניתן למנף כדי ללמוד אינטראקציות גנוטיפ-פנוטיפ בחיידקים. Tn-seq ישימה באופן נרחב על פני פתוגנים חיידקיים, שם היא משלבת מוטאגנזה טרנספוסון מסורתית עם רצף מקביל מסיבי כדי למפות במהירות אתרי הכנסה, אשר ניתן להשתמש כדי לקשר מוטציות DNA לגרסאות פנוטיפיות בקנה מידה רחב גנומי^32,33,34,35. בעוד שיטות mutagenesis transposon תוארו בעבר, השלבים הכלליים דומים³³. ראשית, ספריית הכנסה נוצרת באמצעות מוטאגנזה transposon, שבו כל תא חיידקי בתוך אוכלוסייה מוגבלת חדף transposon החדרה בתוך ה-DNA הגנומי (gDNA). בעקבות מוטגנזה, מוטנטים בודדים הם מאגר. gDNA מופק מבריכת מוטציה הכניסה וצמתים transposon מוגברים ונותנים לתפוקה גבוהה רצף. הקריאה מייצגת אתרי הכנסה, שניתן למפה לגנום. הוספות טרנספוסון המפחיתות את הכושר נופלות במהירות מהאוכלוסייה, בעוד הוספות מועילות מועשרות. Tn-seq כבר אינסטרומנטלי כדי לקדם את ההבנה שלנו של איך גנים להשפיע על כושר חיידקי בלחץ^33.

מערכת הטרנס פוסון הימית Himar1 המקודדת ב- pJNW684 נבנתה ומוטבה במיוחד למטרת מוטאגנזה טרנספוסון. הוא כולל טרנספוסוןימי-משפחה המאגף את גן ההתנגדות kanamycin, אשר משמש לבחירה של מוטציות החדרת transposon ב A. baumannii. הוא גם מקודד יזם ספציפי A. baumannii שמניע ביטוי של גן קידוד transposase³⁶. הטרנספוןמבוסס הימאים מכיל גם שני מחסלים תרגום במורד הזרם של גן התנגדות kanamycin, אשר מונע קריאה במורד הזרם של^{הכניסה 37}. pJNW684 נושא גם RP4/oriT/oriR6K-מותנה מקור של שכפול אשר דורש את הגן ωpir תרם על ידי זן^{התורם לשכפל 38.} בהיעדר הגן, וקטור pJNW684 הנושא את מכונות הטרנספוזיציה לא יוכל לשכפל במקבל A. baumannii ^{זן 10,36,38}. לכן, במהלך התייחדות חיידקים, רק transposon מוכנס לתוך הגנום הנמען ללא החדרת רקע של פלסמיד, אשר נושא את הגן transposase. הדבר משמעותי משום שהאובדן של פעילות הטרנספוז יחד עם הפלסמיד גורם לאירוע טרנספוזיציה יחיד ויציב שמונע מהטרנספוסון לעבור למיקומים שונים ברגע שהוא מוסיף לגנום הנמען.

pJNW648 נבדק גם לפעילות באורגניזם גרם שלילי אחר, E. coli. הרכבה מוצלחת של ספריית Tn-seq רוויה בזן E. coli W3110 הצביע על המערכת היא נוחה לבצע mutagenesis במגוון רחב של פתוגנים, כולל Enterobacteriaceae. יתר על כן, היזם הספציפי A. baumannii שמניע ביטוי transposase יכול להיות מוחלף במהירות עם יזם ספציפי למין. לבסוף, הגן התנגדות kanamycin ניתן להחליף קלטות התנגדות אחרות, בהתאם פנוטיפ AMR של האורגניזם נחקר.

גורם אחד שתורם להתנגדות קוליסטין ב- Baumannii הוא ניהול של מינונים לא מספיקים, שבו חיידקים נחשפים ללחץ סלקטיבי ברמות לא^{קטלניות 39}. מספר דיווחים הראו כי ריכוזים מיקרוביאליים תת-נפחיים יכולים לגרום לתגובות מוסדרות שמשנות את הפיזיולוגיה של התא כדי להפחית את הרגישות של כל אוכלוסיית^{החיידקים 11,12,30,31}. באמצעות Tn-seq, גילינו גורמים המסדירים את התנגדות קוליסטין ב A. baumannii זן ATCC 17978 לאחר^{חשיפה מעכב 10 וריכוזים} subinhibitory של קוליסטין. דוגמה זו מפרטת שיטת Tn-seq המייעלת את הבנייה וההעשרה של ספריית מוטציה רוויה הטרנספוסון באמצעות משפחת הטרנספוסון^40,41. בעוד מספר פרוטוקולי Tn-seq מייצרים 20,000 – 100,000 מוטנטים^{35,42,43,44,45,46}, הפרוטוקול המתואר בזאת יכול ליצור במהירות ספריית transposon של 400,000 + מוטנטים, אשר בערך משווה להחדרת transposon כל 10 זוגות בסיסים ב A. baumannii^10. יתר על כן, ניתן לשנות את גודל הספרייה ללא מאמץ נוסף משמעותי. שיטה זו גם מבטלת את הדרישה למגבלות אנדונו-ליאות, קשירה של מתאם וטיהור ג’ל, מה שיכול להפחית את הגיוון הסופי בספרייה.

Protocol

1. הכנת זן חיידקי פס זן “תורם” (E. coli MFD DAP-/ pJNW684, Table of Materialsטבלת חומרים ) עבור מושבות מבודדות על לוריה-Bertani אגר בתוספת עם 600 μM חומצה דיאמונופלית (DAP), 100 מ”ג / L של אאמפיצילין ו 25 מ”ג / L של kanamycin. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. באמצעות מושבה מבודדת אחת, לחסן 50 מ”ל של מרק לוריה (LB) בתו…

Representative Results

השיטות המתוארות מתארות את הדור של ספריית טרנספוסון בצפיפות גבוהה ב- A. baumannii זן ATCC 17978 באמצעות התייחדות חיידקים באמצעות E. coli MFD DAP- ,אשר משכפל את pJNW684 plasmid (איור 4B). הפרוטוקול המפורט משתמש בהתייחדות חיידקים דו-הורית להעברת pJNW684 מהזן E. coli ρpiir+ תורם לזן מ…

Discussion

א. באומאני מהווה איום עולה על בריאות הציבור העולמית בשל הרכישה המהירה של AMR מול טיפולי “השורה האחרונה”, כגון colistin^10,11,^{12,,23,24,30,31}. בעשורים האחרונים, Tn-seq שיחק תפקי?…

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875